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.2020年6月;45(6):1888-1908.
doi:10.3892/ijmm.2020.4560。 Epub 2020年3月31日。

热休克蛋白90通过调节Akt和PKM2信号通路减轻心肌细胞热应激损伤

附属公司

热休克蛋白90通过调节Akt和PKM2信号通路减轻心肌细胞热应激损伤

张晓慧等。 国际分子医学杂志. 2020年6月.

摘要

热休克蛋白90(Hsp90)与抵抗心脏热应激损伤有关,尤其是在心肌线粒体中。然而,这种作用的机制尚不清楚。本研究基于热应激期间Hsp90的高表达,涉及使用阿司匹林诱导小鼠心脏Hsp90高表达。较高的Hsp90水平通过刺激Akt(蛋白激酶B)激活和PKM2(丙酮酸激酶M2)信号传导,随后增加线粒体Bcl-2(B细胞淋巴瘤2)水平及其磷酸化,抑制HS‑诱导的心肌损伤和凋亡以及线粒体功能障碍。使用格尔德霉素对Hsp90的功能性抑制证实,减少Hsp90与Akt和PKM2的结合会导致磷酸化(p)‑Akt及PKM2功能下降,后者会启动Bcl-2进入线粒体,并在线粒体中磷酸化。Hsp90的保护作用因使用三氯嘧啶阻断Akt激活而减弱,而正常启动PKM2通路无法恢复Akt活化。此外,心肌细胞中Akt激活引起的Hsp70水平升高可能会流入血液以抵抗热应激。该结果提供了体内机制证据,表明在心肌细胞中,Hsp90通过单独激活Akt-Bcl-2和PKM2-Bcl-2信号通路来抵抗热应激,这有助于保持心脏功能和线粒体稳态。

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数字

图1
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续。ASA诱导Hsp90高表达对热应激心脏组织的影响。(D) 受试心肌组织的病理学评分。(E) 显示了Hsp90的代表性蛋白质印迹结果。Hsp90的相对丰度被归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图1
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继续的。ASA诱导Hsp90高表达对热应激心脏组织的影响。(D) 受试心肌组织的病理学评分。(E) 显示了Hsp90的代表性蛋白质印迹结果。Hsp90的相对丰度被归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图1
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继续的。ASA诱导Hsp90高表达对热应激心脏组织的影响。(D) 受试心肌组织的病理学评分。(E) 显示了Hsp90的代表性蛋白质印迹结果。Hsp90的相对丰度被归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图2
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ASA引起的Hsp90水平升高对受试蛋白、心肌细胞共定位、凋亡和线粒体的影响。(A) 显示了Akt、p-Akt、PKM2、Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果,并评估了磷酸化/总蛋白质丰度的比率。(B) 显示Hsp90与Akt或PKM2相互作用的代表性免疫组织荧光染色图像(Hsp90,绿色荧光;Akt/PKM2,红色荧光;细胞核,蓝色荧光;细胞质中Hsp90和Akt/PKM2的合并图像,黄色荧光;细胞核中Hsp90/Akt/PKM的合并图,白色荧光)在心肌组织中。ASA引起的Hsp90水平升高对受试蛋白、心肌细胞共定位、凋亡和线粒体的影响。(C) 高Hsp90丰度对GSH-PX、CAT和MDA水平的影响。(D) 高Hsp90丰度对cyt水平的影响c(c)和半胱天冬酶-3。(E) 各组心肌细胞凋亡率。(F) 显示了心肌线粒体功能mPTP和MMP的检测结果。结果表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图2
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ASA引起的Hsp90水平升高对受试蛋白、心肌细胞共定位、凋亡和线粒体的影响。(A) 显示了Akt、p-Akt,PKM2,Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果,并评估了磷酸化/总蛋白丰度的比率。(B) 显示Hsp90与Akt或PKM2相互作用的代表性免疫组织荧光染色图像(Hsp90,绿色荧光;Akt/PKM2,红色荧光;细胞核,蓝色荧光;细胞质中Hsp90和Akt/PKM2的合并图像,黄色荧光;细胞核中Hsp90/Akt/PKM的合并图,白色荧光)在心肌组织中。ASA引起的Hsp90水平升高对受试蛋白、心肌细胞共定位、凋亡和线粒体的影响。(C) 高Hsp90丰度对GSH-PX、CAT和MDA水平的影响。(D) 高Hsp90丰度对cyt水平的影响c(c)和胱天蛋白酶-3。(E) 各组心肌细胞凋亡率。(F) 显示了心肌线粒体功能mPTP和MMP的检测结果。结果表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图2
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ASA引起的Hsp90水平升高对受试蛋白、心肌细胞共定位、凋亡和线粒体的影响。(A) 显示了Akt、p-Akt,PKM2,Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果,并评估了磷酸化/总蛋白丰度的比率。(B) 显示Hsp90与Akt或PKM2相互作用的代表性免疫组织荧光染色图像(Hsp90,绿色荧光;Akt/PKM2,红色荧光;细胞核,蓝色荧光;细胞质中Hsp90和Akt/PKM2的合并图像,黄色荧光;细胞核中Hsp90和Akt/PKM2的合并图像,白色荧光)在心肌组织中。ASA引起的Hsp90水平升高对受试蛋白、心肌细胞共定位、凋亡和线粒体的影响。(C) 高Hsp90丰度对GSH-PX、CAT和MDA水平的影响。(D) 高Hsp90丰度对cyt水平的影响c(c)和胱天蛋白酶-3。(E) 各组心肌细胞凋亡率。(F) 显示了心肌线粒体功能mPTP和MMP的检测结果。结果表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图3
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ASA处理后较高Hsp90水平对线粒体蛋白质的影响以及细胞内Hsp70对Hsp90的影响。(A) 显示了线粒体HSP90、Akt、p-Akt和PKM2的代表性蛋白质印迹结果,并给出了磷酸化/总蛋白丰度的比率。(B) 显示了线粒体Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果,以及磷酸化/总蛋白丰度的比率。(C) 显示了细胞Hsp70和HSF-1的典型蛋白质印迹结果。(D) 代表性免疫组织荧光染色图像显示了Hsp90和Hsp70之间的共同定位(Hsp90,绿色荧光;Hsp70,红色荧光;细胞核,蓝色荧光;细胞质中Hsp90与Hsp70的合并图像,黄色荧光;细胞核中Hsp70与Hsp90的合并图像、白色荧光)在心肌组织中。比例尺=100微米m.(E)线粒体cyt的代表性蛋白质印迹结果c(c)如图所示。(F) 细胞溶质cyt的典型western印迹结果c(c)图中显示了caspase-3。结果表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较由&&P<0.01。
图4
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Hsp90功能抑制对Hsp90及其相关蛋白水平的影响,以及Hsp90与受试客户蛋白的共同定位。(A) 显示了细胞Hsp90、Akt、p-Akt,PKM2、Hsp70、HSF-1、Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果,并给出了磷酸化/总蛋白质丰度的比值。(B) 代表性免疫组织荧光染色图像显示Hsp90与Akt、PKM2和Hsp70共定位(Hsp90,绿色荧光;Akt/PKM2/Hsp70,红色荧光;细胞核,蓝色荧光;Hsp90和Akt/PKM2/Hsp70在细胞质中的融合图像,黄色荧光;心肌组织中Hsp90和Akt/PKM2/Hsp70在细胞核中的合并图像,白色荧光)。比例尺=100微米m.结果表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较由&&P<0.01。
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Hsp90功能抑制对Hsp90及其相关蛋白水平的影响,以及Hsp90与受试客户蛋白的共同定位。(A) 显示了细胞Hsp90、Akt、p-Akt,PKM2、Hsp70、HSF-1、Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果,并给出了磷酸化/总蛋白质丰度的比值。(B) 显示Hsp90与Akt、PKM2和Hsp70共定位的代表性免疫组织荧光染色图像(Hsp90,绿色荧光;Akt/PKM2/Hsp70,红色荧光;细胞核,蓝色荧光;细胞质中Hsp90和Akt/PKM2/Hsp70的合并图像,黄色荧光;心肌组织中Hsp90和Akt/PKM2/Hsp70在细胞核中的合并图像,白色荧光)。比例尺=100微米m.结果表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&&P<0.01。
图5
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Hsp90功能抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(A) Hsp90功能抑制对心率、呼吸频率和血氧饱和度等生理指标以及与心肌损伤相关的酶活性的影响。(B) 组织病理学检查的H&E染色及其评分的代表性图像。面板a-d分别代表Con、GA、HS和GA+HS组。箭头表示细胞肿胀和变性,箭头表示出血,星号表示坏死和肌纤维断裂。比例尺=100微米m.Hsp90功能抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(C) Hsp90功能抑制对cyt的影响c(c)心脏组织中caspase-3水平。(D) 不同处理对心肌细胞凋亡率的影响。所有蛋白质的相对丰度均归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&&P<0.01。
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Hsp90功能抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(A) Hsp90功能抑制对心率、呼吸频率和血氧饱和度等生理指标以及与心肌损伤相关的酶活性的影响。(B) 组织病理学检查的H&E染色及其评分的代表性图像。面板a-d分别代表Con、GA、HS和GA+HS组。箭头表示细胞肿胀和变性,箭头表示出血,星号表示坏死和肌纤维断裂。比例尺=100微米m.Hsp90功能抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(C) Hsp90功能性抑制对细胞凋亡的影响c(c)心脏组织中caspase-3水平。(D) 不同处理对心肌细胞凋亡率的影响。所有蛋白质的相对丰度均归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&&P<0.01。
图5
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Hsp90功能抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(A) Hsp90功能抑制对心率、呼吸频率和血氧饱和度等生理指标以及与心肌损伤相关的酶活性的影响。(B) 组织病理学检查的H&E染色及其评分的代表性图像。面板a-d分别代表Con、GA、HS和GA+HS组。箭头表示细胞肿胀和变性,箭头表示出血,星号表示坏死和肌纤维断裂。比例尺=100微米m.Hsp90功能抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(C) Hsp90功能抑制对cyt的影响c(c)心脏组织中caspase-3水平。(D) 不同处理对心肌细胞凋亡率的影响。所有蛋白质的相对丰度均归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&&P<0.01。
图6
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Hsp90功能抑制对Hsp90和相关蛋白的线粒体和胞浆水平以及心肌线粒体的氧化水平和功能的影响。(A)显示了线粒体Hsp90、Akt、p-Akt、PKM2、Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果,并给出了磷酸化/总蛋白丰度的比值。(B) 线粒体cyt的典型western印迹结果c(c)和细胞溶质cytc(c)图中显示了caspase-3。(C) Hsp90功能抑制对心肌线粒体氧化水平的影响。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&&P<0.01。
图7
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Akt激活抑制对Hsp90及其相关蛋白水平的影响,以及Hsp90与受试客户蛋白的共同定位。(A) 受试心肌组织中Hsp90、Akt、p-Akt,PKM2、Hsp70、HSF-1、Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果,以及磷酸化/总蛋白丰度的比率。(B) 代表性免疫组织荧光染色图像显示Hsp90与Akt、PKM2和Hsp70的相互作用(Hsp90,绿色荧光;Akt/PKM2/Hsp70,红色荧光;细胞核,蓝色荧光;细胞质中Hsp90和Akt/PKM2/Hsp70融合图像,黄色荧光;心肌组织中Hsp90和Akt/PKM2/Hsp70在细胞核合并,白色荧光)。比例尺=100微米m.所有蛋白质的相对丰度均归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图7
图7
Akt激活抑制对Hsp90及其相关蛋白水平的影响,以及Hsp90与受试客户蛋白的共同定位。(A) 受试心肌组织中Hsp90、Akt、p-Akt,PKM2、Hsp70、HSF-1、Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果,以及磷酸化/总蛋白丰度的比率。(B) 代表性免疫组织荧光染色图像显示Hsp90与Akt、PKM2和Hsp70的相互作用(Hsp90,绿色荧光;Akt/PKM2/Hsp70,红色荧光;细胞核,蓝色荧光;细胞质中Hsp90和Akt/PKM2/Hsp70融合图像,黄色荧光;心肌组织中Hsp90和Akt/PKM2/Hsp70在细胞核合并,白色荧光)。比例尺=100微米m.所有蛋白质的相对丰度均归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图8
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Akt激活抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(A) 心率、呼吸频率、血氧饱和度和血清酶水平对TR的反应。(B)实验小鼠心脏组织的代表性H&E染色图像和病理评分。面板a-d分别表示Con、TR、HS和TR+HS组。箭头表示细胞肿胀和变性,箭头表示出血,星号表示坏死和肌纤维断裂。比例尺=100微米m.Akt激活抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(C) Akt激活抑制对cyt的影响c(c)心脏组织中caspase-3水平。(D) 不同处理下心肌细胞的凋亡率。所有蛋白质的相对丰度均归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较由&P<0.05和&&P<0.01。
图8
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Akt激活抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(A) 心率、呼吸频率、血氧饱和度和血清酶水平对TR的反应。(B)实验小鼠心脏组织的代表性H&E染色图像和病理评分。面板a-d分别表示Con、TR、HS和TR+HS组。箭头表示细胞肿胀和变性,箭头表示出血,星号表示坏死和肌纤维断裂。比例尺=100微米m.Akt激活抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(C) Akt激活抑制对cyt的影响c(c)心脏组织中caspase-3水平。(D) 不同处理下心肌细胞的凋亡率。所有蛋白质的相对丰度均归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图8
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Akt激活抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(A) 心率、呼吸频率、血氧饱和度和血清酶水平对TR的反应。(B)实验小鼠心脏组织的代表性H&E染色图像和病理评分。面板a-d分别代表Con、TR、HS和TR+HS组。箭头表示细胞肿胀和变性,箭头表示出血,星号表示坏死和肌纤维断裂。比例尺=100微米m.Akt激活抑制对心肌损伤和细胞凋亡水平的影响。(C) Akt激活抑制对cyt的影响c(c)心脏组织中caspase-3水平。(D) 不同处理下心肌细胞的凋亡率。所有蛋白质的相对丰度均归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图9
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Akt激活抑制对受试小鼠Hsp90及其相关蛋白的线粒体和细胞溶质水平、心肌线粒体的氧化水平和功能的影响,以及不同处理对血清Hsp70水平的影响。(A) 线粒体Hsp90、Akt、p-Akt,PKM2、Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果。(B) 线粒体cyt的典型western印迹结果c(c),和胞质胞苷c(c)和半胱天冬酶-3。(C) Akt激活抑制对心肌线粒体氧化水平的影响。(D)Akt活化抑制分别对心肌线粒体mPTP和MMP开放的影响。(E) 不同处理对受试小鼠血清Hsp70水平的影响。所有蛋白质的相对丰度均归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±标准差;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图9
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Akt激活抑制对受试小鼠Hsp90及其相关蛋白的线粒体和细胞溶质水平、心肌线粒体的氧化水平和功能的影响,以及不同处理对血清Hsp70水平的影响。(A) 线粒体Hsp90、Akt、p-Akt,PKM2、Bcl-2和p-Bcl-2的代表性蛋白质印迹结果。(B) 线粒体cyt的典型western印迹结果c(c)和细胞溶质cytc(c)和半胱天冬酶-3。(C) Akt激活抑制对心肌线粒体氧化水平的影响。(D)Akt活化抑制分别对心肌线粒体mPTP和MMP开放的影响。(E) 不同处理对受试小鼠血清Hsp70水平的影响。所有蛋白质的相对丰度均归一化为β-肌动蛋白的丰度。所有结果均表示为平均值±SD;n=5。*P<0.05和**与对照组相比P<0.01,#P<0.05和##与ASA+HS相比P<0.01,ASA和HS之间的比较表示为&P<0.05和&&P<0.01。
图10
图10
示意图总结了Hsp90通过激活Akt和PKM2信号对心肌组织热应激损伤的保护作用。这个体内实验表明,Hsp90促进Akt磷酸化、线粒体易位和PKM2线粒体易位,从而增加下游线粒体Bcl-2及其磷酸化水平。这有助于保护心脏功能和线粒体稳态,并减轻热应激心肌细胞的氧化应激和凋亡。此外,包括Hsp90在内的几种途径可以激活Akt信号,然后通过HSF-1调节Hsp70水平。Hsp70与Hsp90相互作用,影响其下游蛋白。心肌Hsp70可以泄漏到血液中,启动另一种保护机制。

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