跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2020年3月10日11:352。
doi:10.3389/fimmu.2020.00352。 eCollection 2020。

登革病毒血清2型及其非结构蛋白2A和2B激活NLRP3炎性体

高拉夫·施里瓦斯塔瓦 1, 乔瓦尼·维索索·卡瓦贾 1, 朱利奥·加西亚-科尔多 1, 莫伊斯·莱昂·华雷斯 2, 比比亚娜·查韦兹·蒙吉亚 3, 托马斯·洛佩兹 4, 波菲里奥·纳瓦 5, 尼科拉斯·维莱加斯·塞普尔维达 1, Leticia Cedillo-Barron公司 1
附属公司

登革病毒血清2型及其非结构蛋白2A和2B激活NLRP3炎性体

高拉夫·施里瓦斯塔瓦等。 前部免疫. .

摘要

登革热是人类最普遍、传播最快的蚊媒病毒性疾病。病毒感染的基本先天免疫反应之一包括通过激活炎症小体处理和释放促炎细胞因子，如白细胞介素（IL-1β和IL-18）。登革热病毒刺激Nod-like receptor（NLRP3-特异性炎性体），然而，登革病毒激活NLRP3炎性体的具体机制尚不清楚。在这项研究中，我们研究了登革热病毒感染后内皮细胞（HMEC-1）中NLRP3炎症小体的激活。我们的结果表明，登革热感染以及NS2A和NS2B蛋白的表达增加了NLRP3炎性小体的激活，并通过caspase-1激活进一步增加了含有caspase募集域（ASC）的凋亡相关斑点样蛋白寡聚和IL-1β的分泌。具体而言，我们已经证明，NS2A和NS2B这两种登革热病毒蛋白，作为假定的病毒孔蛋白，足以刺激脂多糖（LPS）诱导的内皮细胞中的NLRP3炎性小体复合物。总之，我们的观察提供了对登革热诱导炎症反应机制的深入了解，并强调了登革热病毒感染期间，DENV-2 NS2A和NS2B蛋白在NLRP3炎性体激活中的重要性。

关键词：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1；IL-1β；NLRP3；登革热；炎症小体；非结构蛋白NS2A和NS2B；病毒孔蛋白。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
DENV-2激活NLRP3炎症小体。HMEC-1在不同时间点感染DENV-2（5 MOI），模拟感染或用LPS（1μg/mL）和ATP（5 mM）治疗作为阳性对照。使用抗NLRP3抗体（1:500）通过蛋白质印迹分析细胞裂解物（A），一种抗NS5抗体（1:100）（B），抗caspase-1抗体（1:1000）（C）或抗ASC抗体（1:1000）（D）在不同时间点用DENV-2（5 MOI）感染HMEC-1，模拟感染或用LPS（1μg/mL）处理6h，然后用ATP（5 mM）处理45min作为阳性对照，在感染后12、24、36和48h收集无细胞上清液，用ELISA分析IL-1β（E）HMEC-1在24和36小时感染DENV-2（5 MOI）或模拟感染。细胞用抗NS5（绿色）和抗ASC（红色）染色，并用共焦显微镜进行分析。对模拟处理的细胞也进行了检查。用DAPI染色观察细胞核（F）.通过共焦显微镜计算每个细胞的ASC点数量（#）。ASC puncta是从总共20个细胞中计算出来的。数据代表了至少三个独立实验，并表明了平均值±S.D。（E、F）.*P（P）< 0.05,**P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001. ns，不显著。
图2
图2
NS2A蛋白在HMEC-1细胞中的表达和定位。（A）用编码NS2A-GFP的质粒瞬时转染HMEC-1细胞，并在24和48小时进行分析。细胞固定并通过共焦显微镜进行分析（B）用GFP编码质粒瞬时转染HMEC-1细胞，并用抗GFP抗体（1:1000）对NS2A-GFP蛋白和细胞裂解物进行western blot分析。通道1：分子量（MW），通道2：pEGFPN1转染的裂解液，通道3：pNS2A-GFP转染的细胞裂解液，显示GFP（27 kDa）以及NS2A-GFP（48 kDa（C）为了评估NS2A蛋白的定位，用编码GFP标记的DENV-2 NS2A的质粒转染HMEC-1细胞，并用抗calnexin（ER标记；红色）、抗GM（高尔基体标记；红色）、MitoTracker（线粒体标记；红色）或TOM22（线粒体外膜标记，红色）染色转染24小时后用共焦显微镜观察（D）不同膜细胞器中NS2A-GFP定位的皮尔逊系数。***P（P）< 0.001.
图3
图3
DENV-2病毒孔蛋白、NS2A和NS2B激活NLRP3炎症小体。用编码GFP标记的DENV-2 NS2A、NS2B或pEGFPN1空载体的表达质粒转染HMEC-1细胞36 h，或用LPS（1μg/mL）处理6 h，然后用ATP（5 mM）处理45 min作为阳性对照。用western blot分析细胞裂解物（A）抗NLRP3抗体（1:500），（B）抗ASC抗体（1:1000），以及（C）抗caspase-1抗体（1:1000）。（D）用编码GFP标记的DENV-2 NS2A、NS2B或pEGFPN1空载体的表达质粒转染HMEC-1细胞36 h，或用LPS（1μg/mL）处理6 h，然后用ATP（5 mM）处理45 min作为阳性对照，用ELISA分析无细胞上清中的IL-1β。（E）用编码GFP标记的DENV-2 NS2A、NS2B或pEGFPN1亲本载体的表达质粒转染HMEC-1细胞36 h，或用LPS（1μg/mL）处理6 h，然后用ATP（5 mM）处理45 min作为阳性对照，用抗ASC（Red）染色细胞，并用共聚焦显微镜进行分析。（F）通过共焦显微镜计算每个细胞的ASC点数量（#）。ASC puncta是从总共20个细胞中计算出来的。（G）用pNS2A-GFP或pEGFPN1空载体转染HMEC-1细胞36 h，并用抗NLRP3（1:200）（红色）染色，用共聚焦显微镜进行分析。细胞核通过DAPI染色进行可视化。（H）NS2A-GFP或GFP与NLRP3共同定位的皮尔逊系数。数据代表至少三个独立实验，并表示平均值±S.D。（D、F、H）.**P（P）<0.01和***P（P）< 0.001.
图4
图4
通过CRISPR-CAS 9确认病毒孔蛋白激活炎症小体。（A）表达lentCRISPRv2-GFP/Caspase/ASC的HMEC-1裂解产物通过western blot进行解析。抗ASC的一级抗体以1:1000的稀释度使用。HRP-抗兔作为二级抗体（1:5000）。（B）阿斯克−/−HMEC-1细胞和WT HMEC-1细胞用LPS 1μg/mL引发6小时，然后用GFP、NS2A-GFP和NS2B-GFP转染36小时。阳性对照细胞用LPS 1μg/mL引发6小时，然后用5mM ATP引发45分钟。使用蛋白质印迹分析裂解物。Caspase-1一级抗体以1:1000的稀释度使用。HRP-抗兔作为二级抗体（1:5000）。（C）HMEC-1细胞（WT或ASC−/−)用编码DENV-2 NS2A-GFP、NS2B-GFP或pEGFPN1亲本载体的表达质粒转染36 h，或用LPS（1μg/mL）处理6 h，然后用ATP（5 mM）处理45 min作为阳性对照，用ELISA分析无细胞上清液中的IL-1β。***P（P）< 0.001.
图5
图5
NS2A和NS2B对炎症小体的NLRP3和caspase-1特异性激活。用编码NS2A-GFP、NS2B-GFP或pEGFPN1空载体的表达质粒转染HMEC-1细胞36小时，或用LPS（1μg/mL）处理6小时，然后用ATP（5 mM）处理1小时，作为阳性对照，无论有无格列本脲（200μM）。（A）使用抗Caspase 1抗体（1:1000）通过蛋白质印迹分析细胞裂解物，并且（B）ELISA法检测无细胞上清中IL-1β的含量。（C）用编码NS2A-GFP、NS2B-GFP或pEGFPN1空载体的表达质粒转染HMEC-1细胞36 h，或用LPS（1μg/mL）处理6 h，然后用ATP（5 mM）处理45 min作为阳性对照，在AcVYAD-cmk（50μM）存在或不存在的情况下，用ELISA分析无细胞上清液中的IL-1β。数据代表至少三个独立实验，并表明平均值±S.D。（B、C）.***P（P）< 0.001.
图6
图6
增加细胞内钙的需求++NS2A和NS2B激活NLRP3炎症小体的浓度。用编码NS2A-GFP、NS2B-GFP或pEGFPN1空载体的质粒转染HMEC-1细胞36小时，或用LPS（1μg/mL）处理6小时，然后用ATP（5 mM）处理45分钟，作为阳性对照，在BAPTA-AM（10μM）存在或不存在的情况下。（A）使用抗caspase-1抗体（1:1000）通过western blot分析细胞裂解物，并且（B）ELISA法检测无细胞上清液中IL-1β的含量。数据代表至少三个独立实验，并表示平均值±S.D。（B）.*P（P）<0.05和***P（P）< 0.001. ns，不显著。
图7
图7
DENV-2病毒通道蛋白通过线粒体诱导NLRP3炎症小体。（A）树脂包埋HMEC-1细胞的超薄切片（TME）图像（70 nm），用乙酸铀染色。未感染和DENV-2感染HMEC-1细胞的超微结构分析显示了它们典型的线粒体结构（Mt），由Jeol JEM-1011透射电子显微镜捕获（日本东京JeolLtd.）。（B）为了评估NS2A蛋白在线粒体内的定位，用pNS2A-GFP转染HMEC-1细胞36小时，用线粒体标记物（线粒体标记物；红色）染色，并用共焦显微镜进行分析。（C、D）用编码NS2A-GFP、NS2B-GFP或pEGFPN1亲本质粒的质粒转染HMEC-1细胞36 h，用TMRE（175 mM）染色30 min，在488 nm处用流式细胞仪检测线粒体膜电位（激发峰-595 nm，发射峰-575 nm）。（E）用编码NS2A-GFP、NS2B-GFP或pEGFPN1空载体的表达质粒转染HMEC-1细胞36 h，用LPS（1μg/mL）处理6 h，然后用ATP（5 mM）处理45 min作为阳性对照，在有无Mito-TEMPO（10μM）的情况下，用ELISA分析无细胞上清液中的IL-1β。数据代表至少三个独立实验，并表明平均值±S.D。*P（P）< 0.05,**P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001. ns，不显著。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

  • NLRP3炎性体在RNA病毒感染中的调节和功能。
    Yue Z、Zhang X、Gu Y、Liu Y、Lan LM、Liu Y.、Li Y、Yang G、Wan P、Chen X。 Yue Z等人。 前细胞感染微生物。2024年1月5日；13:1309128. doi:10.3389/fcimb2023.1309128。eCollection 2023年。 前细胞感染微生物。2024 PMID：38249297 免费PMC文章。 审查。
  • 登革热病毒M蛋白促进NLRP3炎症激活导致小鼠血管渗漏。
    潘鹏、张Q、刘伟、王伟、老Z、张伟、沈M、万P、肖福、刘福、张伟，谭Q、刘X、吴凯、刘Y、李刚、吴杰。 Pan P等人。 《维罗尔杂志》。2019年10月15日；93（21）：e00996-19。doi:10.128/JVI.00996-19。2019年11月1日印刷。 《维罗尔杂志》。2019 PMID：31413130 免费PMC文章。
  • EV71 3D蛋白与NLRP3结合并增强炎症复合物的组装。
    王伟、肖福、万P、潘鹏、张毅、刘福、吴凯、刘毅、吴杰。 王伟等。 《公共科学图书馆·病理学》。2017年1月6日；13（1）：e1006123。doi:10.1371/journal.ppat.1006123。eCollection 2017年1月。 《公共科学图书馆·病理学》。2017 PMID：28060938 免费PMC文章。
  • 口蹄疫病毒感染引起的NLRP3炎性体激活主要由病毒RNA和非结构蛋白2B诱导。
    Zhi X、Zhang Y、Sun S、ZhangZ、Dong H、Luo X、Wei Y、Lu Z、Dou Y、Wu R、Jiang Z、翁C、Seong Seo H、郭H。 Zhi X等。 RNA生物学。2020年3月；17(3):335-349. doi:10.1080/15476286.2019.1700058。Epub 2019年12月15日。 RNA生物学。2020 PMID：31840571 免费PMC文章。
  • NLRP3炎性小体组装和激活的结构机制。
    Fu J、Wu H。 Fu J等。 免疫学年度回顾。2023年4月26日；41:301-316. doi:10.1146/annurev-immunol-081022-021207。Epub 2023年2月7日。 免疫学年度回顾。2023 PMID：36750315 审查。
查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. 施密特AC.对登革热的反应——好的、坏的和丑陋的？《新英格兰医学杂志》（2010）363:484-7。10.1056/NEJMcibr1005904-内政部-公共医学
    1. 世界卫生组织登革热：诊断、治疗、预防和控制指南。规范程序Res Train Trop Dis。世界卫生组织；（2009）147网址：https://apps.who.int/iris网站/-公共医学
    1. Vaughn DW、Green S、Kalayanarooj S、Innis BL、Nimmannitya S、Suntayakorn S等。发热早期的登革热：病毒血症和抗体反应。J感染疾病。(1997) 176:322–330. 10.1086/514048-内政部-公共医学
    1. Bozza FA、Cruz OG、Zagne SMO、Azeredo EL、Nogueira RMR、Assis EF等。登革热患者的多重细胞因子谱：MIP-1β和IFN-γ作为严重程度的预测因素。BMC感染性疾病。(2008) 8:86. 10.1186/1471-2334-8-86-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Malavige GN，Ogg GS.登革热病毒感染中血管泄漏的发病机制。免疫学。(2017) 51:261–9. 2011年10月11日/月12748日-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型