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.2020年3月18日；6（12）：每年3335。
doi:10.1126/sciadv.aay3335。 eCollection 2020年3月。

没有DNA证据N个 6-哺乳动物中的甲基腺嘌呤

卡罗洛斯·杜夫拉塔尼奥炎 1, 梅克·本斯伯格 1, 安东尼奥·伦蒂尼 1, 比约恩·吉利莫 1, Colm E Nestor公司 1
附属机构

没有DNA证据N个 6-哺乳动物中的甲基腺嘌呤

卡罗洛斯·杜夫拉塔尼奥炎等。 科技进步. .

摘要

N个 6-甲基腺嘌呤（6mdA）是细菌中广泛存在的一种DNA修饰。最近，6mdA也被用于哺乳动物DNA中。然而，即使是对来自相同哺乳动物细胞类型的DNA进行测量，研究之间对6mdA丰度和剖面的测量也往往非常不同。通过对已发表数据和新的实验方法进行全面的生物信息学分析，我们发现，由于细菌污染、RNA污染、技术限制和抗体非特异性，在哺乳动物中检测6mdA的工作受到严重影响。这些并发症使6mdA成为研究中极为棘手的DNA修饰，并导致在一些哺乳动物系统中错误检测到6mdA。总之，我们的结果强烈暗示，迄今为止发表的证据不足以支持哺乳动物中存在6mdA。

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数字

图1
图1。哺乳动物DNA中6mdA的人工检测。
(A类到C类)免疫斑点杂交显示人CD4中相对6mdA丰度+体外分化过程中的T细胞（A）、原代人和小鼠DNA（B）和培养细胞系（顶部）；他们的WGA控制（中间）和支原体污染状态（底部）。虚线表示使用MycoAlert试剂盒（Lonza）时支原体阳性的阈值（C）。gDNA，基因组DNA；AU，任意单位。(D类)免疫斑点印迹显示三个未经修饰的双链DNA扩增子（2μg）的相对信号强度，腺嘌呤含量降低。(E类)免疫斑点印迹显示聚腺嘌呤（A）、聚胸腺嘧啶（T）或聚胞嘧啶（C）的100-bp单链DNA寡核苷酸的相对信号强度。（A至E）抗6mA抗体：突触系统，编号202003。（A至D）M.b.，亚甲基蓝。（A和B）作为内部控制，显示了10 ng修饰DNA扩增子（数据S2），相当于16 fmol的所示修饰。（A和B）WGA、WGA CD4+T细胞DNA。（A、B、D和E）脱氧腺苷甲基化酶阳性（DAM+)，人CD4+用细菌DAM处理T细胞DNA。
图2
图2。6mdA的人为检测与DIP-seq中的错误映射有关。
(A类)基因组中6mA DIP-seq样品的富集峰数（左）和RepeatMasker重复元件类中的峰分数（右）(n个=1）或WGA(n个=1）GM12878细胞的DNA。相关性采用皮尔逊相关性计算。LTR，长末端重复；正弦，短的散布的核元素。(B类)使用k50-或k100-mers在5mC下的平均峰值可映射性(n个=45），6毫安(n个=15），或从hg38随机采样的区域(n个=100）（左）和每个样品可映射性<50%的峰百分比（右）。方框图表示中值、第一和第三四分位数，晶须延伸1.5×四分位数范围。
图3
图3。与DIP-seq中RNA污染相关的6mdA人工检测。
(A类)DIP-seq信号轨道，用于与Bowtie2或拼接软件STAR对齐的读取。拼接接头对应于STAR对齐的SRR6123785，由绞线着色。插图显示了SRR6123785的成对端读叠加。(B类)6mdA拼接（外显子-内显子）连接处拼接读数的分数(n个=15），5hmC(n个=1）和5mC(n个=3）DIP-seq样品。使用引导重采样基于所有读取计算的每个样本的预期分数(n个= 10,000).
图4
图4。MS中6mdA的人工检测和单分子实时测序。
(A类)高效液相色谱-串联质谱法测定哺乳动物DNA中已发表的6mdA丰度（%6mdA/dA）的Meta分析(n个=34），鼠标(n个=18），清管器(n个=11）和老鼠(n个=7）来自九项独立研究。LOD，检测限。(B类)人类血液或匹配的随机腺嘌呤中甲基化CpG（mCpG）侧翼（±12 bp）单分子实时测序（SMRT-seq）6mdA位点的数量(N个= 881,240; 染色体分布均匀）。(C类)人类血液或匹配的随机腺嘌呤中SMRT-seq 6mdA位点周围的mCpG分布(N个= 881,240; 染色体分布均匀）。(D类)人类淋巴母细胞系（AK1）或匹配的随机腺嘌呤中SMRT-seq-6mdA位点周围的CpG分布(N个= 80,560; 染色体分布均匀）。(E类)小鼠体内6mdA的SMRT-seq和DIP-seq峰重叠的文氏图(n个=4）和人类(n个=4）样本。KO，击倒；外周血单个核细胞。
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