跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2020年2月10日；10(8):3397-3412.
doi:10.7150/thno.42243。 电子采集2020。

新型钙网蛋白纳米粒联合聚焦超声诱导黑色素瘤免疫原性细胞死亡增强抗肿瘤免疫

斯里·南迪尼·塞图拉曼 1, 莫希特·普拉塔普·辛格 1, 少女Patil 1, 李石涛 1, 史蒂文·菲林 2, P杰克篮球 2, 钱丹·古哈 三, 杰里·马莱尔 1, 阿什什·兰扬 1
附属机构

新型钙网蛋白纳米粒联合聚焦超声诱导黑色素瘤免疫原性细胞死亡增强抗肿瘤免疫

斯里·南迪尼·塞图拉曼等。 治疗诊断科技. .

摘要

理论基础一些研究表明，通过上调钙网蛋白（CRT）在实体瘤中的表达，局部激活免疫原性细胞死亡（ICD）可以提高抗肿瘤效果。尽管这是一种很有前途的方法，但目前ICD肿瘤治疗的一个关键挑战是缺乏一种临床上可翻译的方法来重复诱导CRT表达。在此，我们报道了一种新型钙网蛋白纳米粒（CRT-NP），它可以增强ICD，并与聚焦超声（FUS）协同，实现局部和全身抗肿瘤作用。方法：钙网蛋白的全长克隆DNA封装在由DOTAP和胆固醇制成的NP中。每隔2天进行三次20µg的CRT-NP瘤内注射，每次注射后24小时连续进行FUS加热（42-45°C，~15min）以诱导ICD。为了研究ICD特异性免疫效应，对接种CRT-NP（±FUS）处理的B16F10细胞的小鼠脾细胞进行体外TRP-2抗原特异性免疫评价。此外，通过对荷瘤小鼠侧翼区域的黑色素瘤细胞进行再纯化来评估其长期保护作用。结果：CRT-NP加FUS（CFUS）上调CRT表达，扩大黑色素瘤TRP-2特异性功能CD4+和CD8+T细胞和抑瘤M1表型的数量，增加T细胞中PD-1和PD-L1标记物的表达。治疗上，CFUS抑制B16黑色素瘤生长>85%与在未经治疗的对照组中可见，且>~50%与CRT-NP或FUS单独使用，可防止远端未治疗部位的肿瘤生长。结论：CRT-NP增强了FUS和ICD对黑色素瘤的治疗效果，表明所提议的组合方法可能具有临床可翻译性。

关键词：免疫原性细胞死亡；钙网蛋白；聚焦超声；黑色素瘤；纳米颗粒。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
FUS与CRT NPs联合治疗可增加CRT的表达和CRT/CD47的比值。（A） 使用凝胶阻滞试验对CRT-NP进行表征表明，CRT质粒完全封装在NP中。相比之下，空白NP和CRT-NP没有显示带。（B） CRT-NP的透射电子显微镜显示，与空白NP比例尺为100 nm相比，包封质粒具有典型的核壳形态。（C） 使用流式细胞术定量香豆素标记的CRT-NP摄取，显示5-8小时的有效摄取类似于空白NP。香豆素的中位荧光强度（MFI）在24小时时降低，可能是由于NP随着时间的推移而溶解。（D） 与CRT-NPs（2µg DNA）孵育的B16F10细胞的荧光成像显示，高效转染和蛋白表达（橙色）类似于脂质体TM（TM）2000（LF2000）。（E） 流式细胞术分析CRT-NP转染后48小时CRT的表面表达（4µg DNA）如条形图和直方图所示（n=3）。对照（灰色峰）表示未转染的细胞。（F和G）流式细胞术分析转染CRT-NP（1µG DNA）40-42 h，然后进行FUS治疗（n=3）的B16F10细胞的表面CRT表达（F）和CRT/CD47比值（G）。CRT-NP+FUS（CFUS）导致最高的CRT表达和CRT-CD47比率。与CRT-NP相比，（H-I）CFUS增强了肿瘤消退。小鼠用4x10接种皮下注射6转染CRT-NPs±FUS的B16F10细胞（n=5）在CFUS队列中的肿瘤生长相对较慢。数据显示为平均值±SEM。统计数据由ANOVA和Fisher的LSD确定，无需多重比较校正。使用非配对t检验分析对照组和CRT-NP之间的差异。*p<0.05，**p<0.01。
图2
图2
CRT-NP和FUS局部治疗增强了体内的治疗效果，当与CFUS联合使用时会产生协同作用。（A） 测试CFUS对黑色素瘤疗效的实验设计。（B） B16F10黑色素瘤切片的免疫荧光图像显示CRT表达（红色）和细胞核（DAPI蓝色）。与其他组相比，CFUS显著增强了治疗肿瘤的CRT强度（放大10倍）。（C） 各实验组小鼠肿瘤生长曲线。与对照组、FUS和CRT-NP相比，CFUS显著延迟肿瘤生长（n=4-7）。（D） 采用Kaplan-Meier方法确定各组的存活率差异，并通过对数秩和检验计算总P值。（E） 收获肿瘤的代表性图像。（F） 与对照组相比，处死时的肿瘤重量显示治疗组的总重量显著降低。统计数据通过方差分析（ANOVA）和费希尔最小二乘法（Fisher’s LSD）确定，无需多重比较校正。*p<0.05，**p<0.01。
图3
图3
局部CRT-NP和FUS治疗激活抗原提呈细胞并诱导肿瘤中T细胞浸润。（A） 与未经治疗的对照组相比，CFUS和CRT-NP治疗组CD45阴性（-）细胞（肿瘤细胞和成纤维细胞）的百分比降低。单一疗法和CFUS可增强表达活化标记物MHCII的树突状细胞的浸润。直方图显示，与对照组相比，治疗组肿瘤内树突状细胞上表达的MHCII的中值荧光强度（MFI）增加。（B） 与对照组相比，FUS、CRT-NP和CFUS的CD3+细胞数量增加了2-3倍。（C） CFUS肿瘤显示ICAM-1表达比对照组高2倍。（D） 分析肿瘤中巨噬细胞（CD11b+F4/80+）的百分比，以确定M1和M2亚型。M1的MHCIIhi CD86+随着CFUS显著增加，治疗肿瘤中M2亚型的MHCII lo/neg CD206+没有改变。数据显示为平均值±扫描电镜（SEM）、单因素方差分析（ANOVA）和费希尔LSD，无多重比较校正。采用假设方差不相等的非配对t检验分析C组对照组和处理组之间的差异。*p<0.05，**p<0.01。
图4
图4
CFUS提高了B16F10黑色素瘤模型的局部和全身抗肿瘤免疫。（A） 用1x10在小鼠对侧腹进行攻击5B16F10细胞接种原发性肿瘤2周后（n＝4-5）。（B） 治疗肿瘤部位的肿瘤体积显示CFUS和CRT-NP显著下降，尽管肿瘤再灌注对免疫系统施加压力。（C） 远处未治疗部位无肿瘤的小鼠数量。数据显示为平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01；单向方差分析（ANOVA）和费舍尔LSD，无多重比较校正。
图5
图5
评估接种后同一天处死的小鼠引流淋巴结（dLN）和脾组织中的黑色素瘤特异性局部和系统免疫。与未经治疗的对照组（n=3）相比，经TRP-2黑色素瘤抗原体外刺激后，dLN中分泌干扰素-γ的CD8+T细胞的CRT-NP、FUS和CFUS增加了1.5-3倍。与对照组相比，IFN-γ+CD4+T细胞在治疗之间没有变化。与其他组相比，CFUS增强了TRP-2刺激后脾脏中产生（C和D）IFN-γ的CD4+T细胞。治疗组的IFN-γ+CD8+T细胞没有改变（n=3-4）。（E） 与FUS、CRT-NP和对照组相比，CFUS脾脏中M1巨噬细胞的频率增加了约2倍。CFUS治疗后（F-G）M2巨噬细胞减少，导致脾脏中M1/M2比率高于其他队列。（H） 与对照组相比，各治疗组小鼠脾脏重量显著降低。数据显示为平均值±SEM。统计数据通过方差分析（ANOVA）和费希尔最小二乘法（Fisher’s LSD）确定，无需多重比较校正。采用非配对t检验分析E组对照组和治疗组之间的差异，假设方差不相等*p<0.05，**p<0.01。
图6
图6
CFUS增强肿瘤浸润T细胞颗粒酶B的表达。（A和B）CFUS治疗的肿瘤显示颗粒酶B+CD8和CD4 T细胞群的百分比高于其他组（n=4-7）。（C和D）CFUS肿瘤中计算出的%颗粒酶B+T细胞与Foxp3+CD4+Tregs（MFI）的比值最高（n=4-7）。（E） ELISA测定肿瘤内细胞因子。IL-1β在治疗的肿瘤中没有改变（n=3）。与FUS或CRT-NP单独治疗相比，CFUS治疗导致TNF-α显著增加（n=7-8）。数据显示为平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01；单向方差分析（ANOVA）和费舍尔LSD，无多重比较校正。
图7
图7
基于CRT的ICD治疗调节肿瘤和T细胞的检查点标记。采用流式细胞术和western blot分析治疗肿瘤中PD-L1和PD-1的表面表达，显示为平均值±SEM。（A）CFUS和CRT-NP显著提高PD-L1+TIL的百分比（n=3-4）。（B） PD-L1+肿瘤细胞的频率不随治疗而改变。（C） 肿瘤粗膜组分PD-L1的代表性蛋白质印迹。Na+/K+ATP酶用作负荷对照（n=4-7）。（D） CD3+CD8+T细胞上PD-1的表达表现为中位荧光强度（MFI）。直方图显示各组PD-1 MFI的差异。（E） PD-1+CD8+T细胞与Granzyme B+CD8+T细胞的关系在反应小鼠中表现出相关性。皮尔逊系数r=0.644，p<0.01。统计数据通过方差分析（ANOVA）和费希尔最小二乘法（Fisher’s LSD）确定，无需多重比较校正。*p<0.05，**p<0.01。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Leach DR，Krummel MF，Allison JP。通过CTLA-4阻断增强抗肿瘤免疫。《科学》（纽约，NY）1996；271:1734–6.-公共医学
    1. Butte MJ、Keir ME、Phamduy TB、Sharpe AH、Freeman GJ。PD-L1与B7-1特异性相互作用，调节T细胞功能（88.24）Am-Asoc-Immnol；2007-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Curran MA、Montalvo W、Yagita H、Allison JP。PD-1和CTLA-4联合阻断剂可扩张浸润性T细胞并减少B16黑色素瘤内的调节性T细胞和髓细胞。美国国家科学院院刊。2010;107:4275–80之间。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Iwai Y、Ishida M、Tanaka Y、Okazaki T、Honjo T、Minato N。PD-L1对肿瘤细胞逃避宿主免疫系统的作用以及通过PD-L1阻断肿瘤免疫治疗。美国国家科学院院刊。2002;99:12293–7.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Gorbet MJ，Ranjan A.使用免疫佐剂、纳米粒子和检查点抑制剂的癌症免疫治疗：治疗和跟踪免疫治疗反应的最新进展和挑战。药物疗法；2019年，第107456页。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语