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.2020年3月18日；21(6):2094.
doi:10.3390/ijms21062094。

PDI介导的PSD95上二硫键的减少通过调节NR2A-PSD95相互作用增强癫痫大鼠的自发性癫痫活动S公司-硝基化

李达信 1, 金继恩（Ji-Eun Kim） 1
附属公司

PDI介导的PSD95上二硫键的减少通过调节独立于S公司-硝基化

李达信等。 国际分子科学杂志. .

摘要

突触后密度-95（PSD95）是一种主要的支架蛋白，在将N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）偶联到中枢神经系统的细胞信号网络中至关重要。PSD95 N端的两个半胱氨酸残基是二硫键的潜在位点，S公司-亚硝化和/或棕榈酰化。蛋白质二硫键异构酶（PDI）将各种蛋白质上的二硫键（S-S）还原为游离巯基（-SH）。然而，PDI参与二硫键的形成/S公司-PSD95的亚硝化作用及其在癫痫中的作用尚不清楚。在本研究中，急性发作活动显著增加了PDI与NR2A的结合，但没有增加PDI与PSD95的结合，同时降低了NR2A-PSD95的结合。此外，匹罗卡品诱发的癫痫发作增加了PSD95上亚硝基（SNO-）硫醇的数量，而不是总（游离和SNO-的）硫醇。与急性发作不同，自发性发作大鼠表现出PDI-PSD95结合、PSD95总硫醇和SNO-硫醇水平以及NR2A-PSD95相互作用的增加。PDI siRNA有效地降低了PSD95和NR2A-PSD95关联的总巯基水平，从而降低了自发癫痫活动。这些发现表明，PDI介导的二硫键形成减少可能促进NR2A-PSD95结合，并有助于癫痫动物自发癫痫的发生。

关键词：癫痫；一氧化氮；氧化还原；癫痫；小干扰RNA；硫醇。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者没有利益冲突需要披露。我们确认，我们已经阅读了该杂志关于道德出版物所涉及问题的立场，并确认本报告符合这些准则。

数字

图1
图1
注射PILO后NO和EEG的实时同步监测。注射PILO后NO水平升高，在SE期间逐渐升高。安定治疗使总脑电图功率恢复到基础水平，但NO水平没有恢复。(A类)代表性NO浓度（上面板）、EEG描记（中面板）和频率功率谱时间图（下面板）对PILO的响应。(B类)PILO反应中NO水平和总脑电图功率的量化（平均值±SEM*第页<0.05 vs.基础水平，重复测量单因素方差分析；n个分别为7）。
图2
图2
急性癫痫发作对PSD95和NR2A上总硫醇和SNO-硫醇水平的影响，以及海马中NR2A–PSD95、PDI–PSD1995和PDI–NR2A的结合。(A类)PSD95和NR2A上总硫醇和SNO-硫醇的表达和数量的代表性Western blot。急性癫痫发作会增加PSD95上SNO-硫醇的数量，但不会增加硫醇总量。(B类,C类)Western blot数据的量化。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05 vs.生理盐水，学生t吨-测试，n个分别=7）。(天)急性发作后NR2A–PSD95相互作用的协同免疫沉淀分析。急性发作降低PSD95和NR2A的表达。然而，与盐处理动物相比，NR2A–PSD95结合显著降低。(E类)Western blot数据的量化。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05 vs.生理盐水，学生t吨-测试，n个分别=7）。(F类)PDI与PSD95和NR2A相互作用的共免疫沉淀分析。急性发作增加PDI表达和PDI–NR2A结合，但不改变PDI–PSD95结合。(G公司)Western blot数据的量化。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05 vs.生理盐水，学生t吨-测试，n个分别=7）。
图3
图3
急性癫痫发作后齿状回上叶外分子层PSD95、NR2A和PDI定位的典型双免疫荧光照片。(A类)齿状回上叶PSD95和MAP2的低倍照片。酒吧 = 50微米。缩写：OML，外分子层；MML，中间分子层；IML，内分子层；DG，齿状颗粒细胞层。(B类)急性癫痫诱导MAP2阳性树突上PSD95点减少。箭头表示癫痫发作活动引起的珠状（损伤性）树突。右侧面板是矩形的高倍图像。酒吧 = 10（左三个面板）和2.5（右面板）μm。(C类)PSD95、NR2A和PDI在齿状回分子层中的共定位改变。急性癫痫发作后，NR2A:PSD95的共定位减少。急性发作活动增加PDI:NR2A的共定位，而不影响PDI:PSD95的共定位。酒吧 = 5 微米。右侧面板显示了共聚荧光强度的量化。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05 vs.生理盐水，学生t吨-测试，n个分别=7）。
图4
图4
PSD95和NR2A上总硫醇和SNO-硫醇的数量，以及癫痫大鼠海马中NR2A–PSD95、PDI–PSD95%和PDI–NR2A的结合。(A类)PSD95和NR2A上总硫醇和SNO-硫醇的表达和数量的代表性Western blot。与对照动物相比，癫痫大鼠PSD95上的总硫醇和SNO-硫醇水平增加，而PSD95的表达没有改变。此外，尽管NR2A的表达减少，但它们显示NR2A上的总硫醇和SNO硫醇水平增加。(B类,C类)Western blot数据的量化。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05 vs.生理盐水，学生t吨-测试，n个分别=7）。(天)癫痫大鼠NR2A–PSD95相互作用的共免疫沉淀分析。与对照动物相比，NR2A–PSD95结合显著增加。(E类)Western blot数据的量化。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05 vs.生理盐水，学生t吨-测试，n个分别=7）。(F类)癫痫大鼠PDI–PSD95和PDI–NR2A联合组分的联合免疫沉淀分析。与对照动物相比，癫痫大鼠PDI–PSD95和PDI–NR2A的结合增强。(G公司)Western blot数据的量化。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05 vs.生理盐水，学生t吨-测试，n个分别=7）。
图5
图5
PDI敲除对癫痫自发性发作活动和NO生成的影响。(A类)对照siRNA融合和PDI siRNA融合癫痫动物的代表性NO浓度和脑电图描记。在对照siRNA-融合动物中，NO水平在自发发作后立即升高，在发作停止后逐渐降至基础水平（左图）。在PDI siRNA-融合动物中，由于没有自发发作活动，no水平没有变化（右侧面板）。(B类)PDI siRNA对自发性癫痫活动的抗惊厥作用：平均癫痫发作频率（左）、癫痫发作持续时间（中）和行为性癫痫评分（右）。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05与对照siRNA、Kruskal–Wallis试验和Dunn多重比较试验，n个分别=7）。PDI敲除抑制癫痫大鼠的自发癫痫活动。
图6
图6
PDI敲低对癫痫大鼠海马中PSD95和NR2A上的总硫醇和SNO硫醇量以及NR2A–PSD95、PDI–PSD95和PDI–NR2A结合的影响。(A类)PSD95上总硫醇和SNO-硫醇的表达和数量的代表性Western blot。与对照siRNA相比，PDI siRNA降低了PSD95上的PDI蛋白水平和总硫醇水平，而不改变PSD95的表达。PDI siRNA也有效降低癫痫大鼠NR2A上的总硫醇水平，但不降低SNO-硫醇水平。(B类,C类)Western blot数据的量化。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05 vs.生理盐水，学生t吨-测试，n个分别=7）。(天)癫痫大鼠NR2A–PSD95相互作用的共免疫沉淀分析。PDI击倒显著降低了NR2A–PSD95结合。(E类)Western blot数据的量化。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05 vs.生理盐水，学生t吨-测试，n个分别=7）。(F类)癫痫大鼠PDI–PSD95和PDI–NR2A联合组分的联合免疫沉淀分析。PDI–PSD95和PDI–NR2A结合被PDI siRNA减弱(G公司)蛋白质印迹数据的定量。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*第页<0.05 vs.生理盐水，学生t吨-测试，n个分别=7）。
图7
图7
PDI敲除对癫痫大鼠齿状回上叶外分子层PSD95、NR2A和PDI定位的影响。(A类)PDI-siRNA不影响癫痫大鼠MAP2阳性树突上PSD95点的密度。箭头表示由咬合活动引起的树枝晶串珠（损坏）。右侧面板是矩形的高倍图像。酒吧 = 10和2.5 微米。(B类)PSD95、NR2A和PDI在齿状回分子层的共定位改变。与对照动物相比（见图3B），癫痫动物中NR2A:PSD95、PDI:PSD1995和PDI:NR2A的共定位升高。与对照siRNA相比，PDI siRNA显著降低了它们。Bar=5μm。右侧面板显示了共聚荧光强度的量化。打开的圆圈表示每个单独的值。水平条表示平均值。误差条表示SEM(*,#第页分别与对照动物和对照siRNA相比<0.05，单向方差分析，n个分别=7）。
图8
图8
急性和癫痫模型中PDI在癫痫活动中的作用方案。PILO诱导的急性发作活动增加PDI与NR2A的结合，但不增加PSD95的结合，以及NR2A上的总（游离和SNO-）硫醇水平。然而，它降低了NR2A与PSD95的结合。与急性发作模型不同，癫痫发作增加了PSD95上PDI-PSD95结合、总硫醇和SNO-硫醇水平，以及NR2A-PSD95相互作用。由于PDI siRNA有效抑制自发癫痫活动，我们的研究结果表明，PDI介导的PSD95氧化还原可能通过促进NR2A–PSD95在癫痫动物中的结合而增加癫痫易感性，与S公司-PSD95的亚硝化。
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