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.2020年2月3日5:16。
doi:10.12688/wellcomeopeners.15626.1。 eCollection 2020。

体外人干细胞培养监测神经元发育和功能中的钙信号

Yojet Sharma公司 1, 桑哈尼尔·萨哈 1, 阿努·约瑟夫 1, 哈里尼·克里希南 1, 帕丁尼亚特·拉胡 1 2
附属公司

体外人类干细胞来源的培养物监测神经元发育和功能中的钙信号

Yojet Sharma公司等。 Wellcome开放研究. .

摘要

人类大脑的发育涉及多种细胞过程，包括细胞分裂、迁移和树突生长。这些过程由发育线索触发，导致神经元和胶质细胞相互作用，从而形成大脑的最终复杂组织。发育线索通过包括钙在内的多个细胞内第二信使的作用被转导到细胞过程中。细胞中的钙信号是由大量蛋白质形成的，其中一些蛋白质的突变已在患有大脑疾病的患者中被报道。然而，这种突变影响人类大脑发育的方式体内人们对其仍知之甚少。这方面的一个关键限制是需要一个模型系统，在该系统中可以研究特定脑疾病患者的神经元中的钙信号。在这里，我们描述了一种将人类神经干细胞分化为皮层神经网络的方案，这种皮层神经网络可以作为活培养物在培养皿中保存120天。我们的协议生成2D在体外展示人类大脑皮层多层分子特征的培养物。利用细胞内钙水平的荧光成像，我们描述了发育过程中通过细胞内钙瞬变测量的神经元活动的发展在体外这些瞬变依赖于电压门控钙通道的活性，并通过阻断钠通道活性而被消除。通过转录组分析，我们描述了分化后这些培养物的完整分子组成在体外从而提供了对活性分子基础的见解。我们的方法将有助于理解特定脑疾病患者皮层神经元发育过程中的钙信号缺陷，并利用基因操作结合细胞生物学和生理学分析对这些缺陷进行机理分析。

关键词：干细胞；钙成像；菜肴中的疾病；人脑疾病；神经元分化；转录组学。

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没有披露任何竞争利益。

数字

图1。
图1.XCL-1神经干细胞（NSC）的特征。
(A类)通过核型分析确定神经干细胞的细胞遗传学特征。XCL1中期扩展的染色体图像，显示22对常染色体、X和Y染色体的正常数目和带型。(B类)XCL1的增殖曲线，其值表示为3次独立测量的平均值±SEM。Y轴表示细胞数量，X轴表示年龄（小时）(C类)XCL-1的共聚焦图像显示（i–iii）Nestin/SOX1的表达。（iv–vi）Nestin/SOX2和（vii–ix）Ki-67/DAPI的共焦图像。神经干细胞在其典型的神经玫瑰花结形态中被定期观察到。该面板中的共焦图像使用ImageJ进行亮度调整，以获得更好的可视化效果。比例尺50μm。
图2。
图2 XCL-1神经干细胞（NSC）的神经分化。
(A类)神经元维持和分化的示意图。顶行显示介质名称，底行显示每种情况下添加的生长因子和其他小分子。文化的年龄以天为单位显示如下在体外（DIV）。(B类)分化过程中NSC和培养物的相位对比图像。在每个时间点，用免疫细胞化学染色（ICC）、qRT-PCR和钙显像对细胞进行表征。（i） 7 DIV（ii）14 DIV（iii）21 DIV（iv）30 DIV（v）45 DIV和（vi）60 DIV。在7 DIV中观察到一些细胞死亡，在培养过程中逐渐减少；（ii）通过14个DIV，观察到双极神经元形态（iii–vi）从21个DIV-60个DIV细胞开始聚集在一起，并以50μm的比例尺铺开。
图3。
图3神经元与神经干细胞分化的特征。
(A类)至(E类)从qRT-PCR获得神经元分化阶段早期和晚期神经元标记物的相对mRNA表达水平。图A和图B显示了早期神经元标记物的相对表达大号b3和DCX公司，图C、D和E显示NEFH公司,地图2和NEUN公司分别是。X轴以天为单位显示文化的年龄在体外（DIV）。每个转录本的表达水平已经用标准化GAPDH公司作为内生控制和用2表示的值-∆Ct，平均值±SEM。采用单因素方差分析进行统计分析，p<0.05具有显著性。(F类)免疫荧光图像（最大强度投影）显示神经干细胞的神经元分化阶段。用神经元标记物TUBB3/β-微管蛋白III（绿色）、NFEH/神经丝重多肽（红色）和MAP2（洋红色）对细胞进行染色，然后用DAPI（蓝色）进行复染。数字i至v代表21 DIV，vi至x代表30 DIV，xi至xv代表45 DIV，xvi至xx代表60 DIV。比例尺：20μm。
图4。
图4皮层神经元标记物的表达
(A类)至(C类)皮层神经元层标记物的相对mRNA表达水平CTIP2公司,立方厘米1和SATB2标准在从定量实时PCR（qRT-PCR）获得的神经元分化的不同阶段。表达式级别已使用规范化GAPDH公司作为内生控制和用2表示的值-∆Ct-Y轴，平均值±SEM。采用单因素方差分析进行统计分析，p<0.05被认为具有显著性。(天)培养21天后观察到的未成熟神经元标记物DCX（红色）和V层标记物CTIP2（绿色）的代表性图像在体外（DIV）之后。(E类)用成熟神经元标记物MAP2（红色）对60个DIV神经元进行免疫染色，以验证是否存在表达CTIP2（绿色）的成熟神经元。
图5。
图5.突触和胶质标记在体外区别。
(A类)至(C类)突触标记物的相对mRNA表达水平SYN（同步）,梅毒和PSD95型在神经元分化阶段，通过定量实时PCR（qRT-PCR）获得。表达式级别已使用规范化GAPDH公司作为内生控制和用2表示的值-∆Ct-Y轴，平均值±SEM(天)突触前蛋白突触蛋白1（黄色）和(E类)MAP2（红色）阳性神经元细胞中的突触囊泡蛋白突触体素（黄色）。DAPI（蓝色）染色观察细胞核。(F类)至(H（H）)GABA能神经元标记物相对mRNA表达的qRT-PCR结果加德67和谷氨酸能神经元标记物GLS公司和VGLUT1型分别是。(我)和(J型)星形胶质细胞和少突胶质细胞标记物的相对mRNA表达水平GFAP公司和OLIG2公司分别在神经元分化的不同阶段，如qRT-PCR所示。所有基因的表达水平都经过标准化处理GAPDH公司作为内生控制和用2表示的值-∆Ct，平均值±SEM。采用单因素方差分析进行统计分析，p<0.05具有显著性。(K（K）)免疫荧光图像（最大强度投影）显示神经干细胞神经元分化阶段GFAP（洋红色）和OLIG2（绿色）的表达。细胞用星形胶质细胞标志物GFAP和少突胶质细胞标记物OLIG2染色，然后用DAPI（蓝色）进行复染。图i至iv表示21 DIV，v至viii表示30 DIV，ix至xii表示45 DIV，xiii至xvi表示60 DIV。比例尺：20μm。
图6。
图6钙的发展2+瞬态期间体外区别。
(A类)至(E类)显示了在7、14、21、30和45 DIV时记录的钙瞬变。每个面板显示[Ca2+]我培养皿中单个细胞的痕迹。Y轴显示ΔF。X轴是以s为单位的时间。记录基线4分钟，然后添加10μM河豚毒素（TTX）（如箭头所示）以阻断Ca2+瞬态。(F类)从7 DIV（i）和60 DIV（ii）培养物中记录的钙瞬变。显示单个单元格的轨迹。在指定的点使用L型VGCC阻断剂尼莫地平（10μM），并完全消除瞬变。(G公司)对每个年龄段的单个神经元每4分钟的棘波数进行计数并绘制图表。散点图上的符号对应于单个神经元。30–40个神经元的平均值±SEM。(H（H）)量化分析和装箱的钙瞬变幅度的条形图。X轴显示每个箱子的振幅大小。Y轴显示每个年龄段与箱子大小对应的瞬态比例。
图7。
图7.神经干细胞（NSCs）和在体外分化的皮层神经元
(A类)[钙2+]我在Thapsigargin诱导的储存释放和XCL1 NSC中随后的SOCE期间，使用比例染料Fura-2测量的水平在体外特定年龄的分化皮层神经元。给定年龄段的每条痕迹由25-30个细胞的平均值±SEM组成。(B类)散点图量化静息细胞溶质[Ca2+]我; 每个点代表培养基中的单个细胞。X轴显示培养神经元的年龄（DIV）。（C，D）散点图量化[Ca2+]我高于基础细胞溶质[Ca2+]我的(C类)SOCE和(天)Tg介导的储存释放在不同年龄段在体外文化。qPCR测量显示ORAI不同亚型的相对表达(E类)、STIM(G公司)和IP3受体（ITPR）(F类)处于不同分化阶段。(H（H）)卡通（使用创建生物渲染器)代表在分化NSC中表达的SOCE成分。显示了单个细胞器和膜。SOCE的单个组件以大写粗体显示。主要编码这些细胞中每个成分的基因以斜体显示。（缩写：Gq是G蛋白α亚单位，由基因GNAQ编码；PLC是磷脂酶C，主要表达的亚型是PLCβ1和PLCδ1，分别由PLCB1和PLCD1编码；SERCA（Sarco/内质网Ca2+-ATP酶）主要由ATP2A2基因编码。）
图8。
图8显示45天时神经干细胞（NSC）和神经元钙信号转录组的热图在体外（DIV）和60 DIV。
(A类)显示样本45 DIV和60 DIV之间常见上调基因数量的维恩图：上调基因总数（log2在每个样本中计算FC>+1.5），并在45 DIV和60 DIV之间计算常见上调基因的数量。这些值已绘制为维恩图。(B类)显示样本45 DIV和60 DIV之间常见下调基因数量的维恩图：下调基因的总数（对数2在每个样本中计算FC<-1.5），并在45 DIV45和60 DIV之间计算常见下调基因的数量。这些值已绘制为维恩图。(C类)上调基因：热图表示与神经干细胞相比，45个DIV和60个DIV样本中与钙信号直接相关的基因上调的程度。这些值已按列Z分数进行缩放，缩放范围为-1到+1（蓝色到黄色）。来自HUGO命名法的基因名称在Y轴上表示。热图是使用热图peR制作的。这些基因被分为以下类别：GPCR（G蛋白偶联受体）、AMPA/NMDA受体、PLC（磷脂酶）、Ca2+释放通道，Ca2+泵，Ca2+结合蛋白、VGCC（电压门控钙通道）、VGKCs（电压门限钾通道）和VGSC（电压门限钠通道）。(天)下调基因：热图表示与NSC相比，45个DIV和60个DIV样本中钙信号相关基因下调的程度。这些值已按列Z分数进行缩放，缩放范围为-1到+1（蓝色到黄色）。来自集合命名法的基因名称在Y轴上表示。热图是使用heatmappeR制作的。
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工具书类

    1. Bootman MD，Bultynck G：细胞钙信号传递的基础：初级读物。冷泉Harb Perspect生物。2020年[引自2019年11月7日]；12（1）：pii:a03802。10.1101/cshperspect.a038802-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Berridge MJ，Bootman MD，Lipp P：钙——生命和死亡的信号。自然。1998;395(6703):645–8. 10.1038/27094-内政部-公共医学
    1. Alves VS、Alves-Silva HS、Orts DJB等：神经元和胶质细胞中的钙信号：Cav1通道的作用。神经科学。2019年[引自2019年11月9日]；421:95–111. 2016年10月10日/j.neuroscience.2019.09.041-内政部-公共医学
    1. Pchitskaya E、Popugaeva E、Bezprozvanny I：神经退行性疾病的钙信号和分子机制。细胞钙。2018年[引用日期2019年11月9日]；70:87–94. 2016年10月10日/j.ceca.2017.06.08-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Berridge MJ：钙信号与精神疾病：双相情感障碍和精神分裂症。2014年《细胞组织研究》【引用日期2019年11月9日】；357（2）：477–92。2007年10月1日/00441-014-1806-z-内政部-公共医学

赠款和资金

这项工作得到了Wellcome Trust通过Wellcome-DBT印度联盟PR高级研究员的支持[IA/S/14/2/501540]。这项工作还得到了印度政府生物技术部国家生物科学中心的支持，该中心通过脑疾病发现加速器项目（BT/PR17316/MED/31/326/2015）。AJ得到了印度政府生物技术部研究助理奖学金的支持。我们感谢NCBS成像和NGS设施的支持。