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.2020年2月3日；10(6):2817-2831.
doi:10.7150/thno.38553。 eCollection 2020。

FGF9诱导人脂肪干细胞向雪旺细胞分化

黄嘉伟 1 2, Shih-Yu路 三, 黄子杰 1 2, 布米姆·黄 三, H阳光灿烂 4, 杨尚勋 5, Jih-Ing Chuang公司 5, 薛元毓 6 7 2, 吴一亭 三 8, 吴嘉庆 1 三 7 2
附属公司

FGF9诱导人脂肪干细胞向雪旺细胞分化

黄嘉伟等。 治疗诊断科技. .

摘要

理论基础：脂肪源性干细胞（ASC）在壳聚糖涂层微环境中形成球形，促进ASC分化为神经谱系样细胞（NLCs）的混合群体，但其下划线机制尚不清楚。由于成纤维细胞生长因子9（FGF9）和成纤维细胞受体（FGFRs）在胚胎发育和干细胞分化过程中是神经细胞命运的关键调节器，因此本研究旨在揭示FGF9和FGFRs在促进周围神经再生方面的相互作用。方法：在NLC诱导（FGF9-NLC）期间添加不同浓度的FGF9肽（10、25、50、100 ng/mL）。通过基因和蛋白质表达以及特定FGFR siRNA或商业抑制剂的敲除来研究FGFR的表达和潜在信号。对FGF9 NLCs进行荧光标记，并将其应用于实验大鼠坐骨神经损伤后的神经导管中。结果：在NLC诱导期间，FGFR2和FGFR4显著增加。FGF9处理的FGF9-NLCs球变小，变成表达S100β和GFAP的雪旺细胞（SCs）。FGFR2的特异性沉默降低了FGF9诱导的Akt磷酸化，并抑制了SC的分化。移植的FGF9-NLCs参与髓鞘形成，促进轴突再生，促进神经支配的肌肉再生。FGF9-NLC中FGFR2的敲除导致神经再生的终止。结论：因此，我们的数据证明了FGF9在通过FGF9-FGFR2-Akt途径确定SC命运中的重要性，并揭示了FGF9-NLCs的治疗益处。

关键词：FGF9；FGFR2；雪旺细胞分化；脂肪干细胞；神经圈。

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竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
在神经诱导过程中，神经标记物和FGFRs的分布发生了变化。将ASC接种到壳聚糖涂层的培养皿中进行神经诱导，并在第1天到第3天之间收获细胞。（A） 使用Nestin、NFH和GFAP的western blotting增加的蛋白质表达证明成功诱导ASC的神经谱系样细胞（NLCs）。RT-PCR（B）和western blotting（C）均显示在NLC诱导过程中FGFR2和FGFR4上调。FGFR3在NLC中下调。数据表示三个独立生物重复的平均值±SD。数据根据未分化ASC进行标准化*与未分化ASC相比，p<0.05，**p<0.01。
图2
图2
FGF9引导神经球分化为雪旺细胞（SCs）谱系。(A） 在NLCs诱导过程中，向培养基中添加不同浓度的FGF9。球体的大体形态显示，随着FGF9浓度的增加（0至100 ng/ml），神经球的尺寸减小##与车用NLC相比，p<0.01。（B） RT-PCR结果显示，随着FGF9的处理，Nestin、GFAP和S100β的基因表达增加，而NeuN的基因表达减少；这些变化呈剂量依赖性。在给予FGF9（50ng/ml）的情况下，诱导3天后，通过蛋白质印迹（C）和免疫荧光染色（D）观察SCs中GFAP和S100β蛋白表达的诱导。通过特异性抗体染色和RFP标记来说明蛋白质表达水平。细胞数量和球体大小用DAPI（合并图像中的蓝色）表示。相位图中的比例尺：200μm。荧光图像中的比例尺：200μm。数据表示三个独立生物重复的平均值±SD*与未分化ASC相比，p<0.05#与载体处理的NLCs相比，p＜0.05。
图3
图3
FGF9治疗在NLC诱导过程中激活FGFR2和Akt信号。（A） 在指定的时间点用或不用FGF9（50ng/ml）处理ASC和NLC，以研究Akt和ERK下游信号的磷酸化。从NLC诱导的第一天开始观察到Akt和ERK的去磷酸化。（B） 尽管Akt和ERK在NLC诱导24小时内持续去磷酸化，但FGF9处理在6小时时诱导Akt的短暂激活。（C）在NLC的诱导过程中，磷酸酶抑制剂（PI）的施用可消除球体形成。（D） 通过使用PI处理阻断Akt去磷酸化和防止球体形成增加了细胞死亡的PARP切割（裂解的PARP）。尽管FGF9处理轻微诱导了FGFR2和FGFR4（E）的基因表达，但无论FGF9治疗（F）如何，蛋白表达水平保持不变。p-Akt，磷酸化Akt；T-Akt，总Akt；p-ERK，磷酸化ERK；T-ERK，总ERK。相位图中的比例尺：200μm。数据表示三个独立生物重复的平均值±SD。对于A，与未分化ASC相比，*p<0.05。对于B，与车用NLC相比，#p<0.05。
图4
图4
阻断FGFR2-Akt信号可消除FGF9诱导的SC分化。（A） shFGFR2可消除FGF9诱导的Akt和ERK磷酸化。（B） 阻断FGFR2通过降低GFAP和S100β的表达来阻止FGF9诱导的SC分化。shFGFR1和shFGFR4也抑制了NLC诱导，但shFGFR3没有抑制NLC诱导。（C） 相位图显示，shFGFR2阻碍了FGF9处理后球体尺寸的减小。（D） GFAP和S100β的免疫荧光染色进一步证实了敲除FGFR2时SC标记物和球体大小的消失。（E） LY294006（10μM）对Akt磷酸化的抑制降低了Nestin、NFH、GFAP和S100β蛋白的表达水平，并消除了FGF9诱导的NLC SC分化。应用ERK抑制剂PD98059（10μM）也导致S100β的表达减少，但Nestin和GFAP的表达没有减少。N=3。相位图中的比例尺：200μm。荧光图像中的比例尺：100μm。
图5
图5
在坐骨神经横断模型中，将FGF9直接注入神经导管导致神经再生恶化。（A） 神经丝重链（NFH）免疫荧光染色显示轴突和周围髓鞘的S100β，显示完整坐骨神经的结构。通过石蜡切片上的Luxol Fast Blue染色、半薄切片上的Toludine Blue染色和透射电镜（TEM）进一步观察髓鞘的结构。（B） 在成年SD大鼠中建立神经横断模型，然后用壳聚糖涂层导管（CC）桥接用于药物或细胞应用。H&E和免疫组织化学（IHC）GFAP染色显示，直接将FGF9注入导管（50 ng/mL）导致严重的纤维瘢痕形成；这阻止了6周损伤后的神经再生。（C） 在FGF9直接给药组中，通过IHC染色，Thy1染色减少，层粘连蛋白和p75NTR增加，证实了纤维化疤痕。
图6
图6
应用FGF9诱导的神经干细胞促进髓鞘形成和损伤神经再生。（A） 将NLCs或FGF9诱导的NLCs（NLC-FGF9）植入神经导管（CC），桥接切断的神经。大体形态图像（1标准row）显示损伤6周后再生的坐骨神经。P： 近端神经；D： 远端神经。通过半薄切片（2第行）神经组织中段（白盒区1标准行）。S100β的免疫荧光染色显示了移植的双标记FGF9-NLC在环形髓鞘结构上的共同定位（箭头所示）。放大NLC（区域1）和FGF9-NLC（地区2）治疗的黄色方框图像。（B） 定量分析显示FGF9-NLCs治疗后神经纤维直径和髓鞘G比率有所改善。（C） GAP43的免疫荧光染色显示，在NLC治疗中，髓鞘形成上存在未成熟的SCs，而应用FGF9-NLCs导致成熟SC标记物MBP的阳性染色。（D） 腓肠肌肌萎缩的明显预防说明坐骨神经的恢复。RGMW和腓肠肌纤维横截面积的定量结果。比例尺：40μm。N=3。数据表示为三个独立生物重复的平均值±SD*与PBS相比p<0.05。与NLC相比p<0.05。
图7
图7
shFGFR2，而不是shFGFR3，废除了FGF9-NLCs促进再髓鞘化的能力。（A） 将NLC或FGFR2或FGFR3沉默的FGF9-NLC移植到神经导管中。神经和腓肠肌的大体形态表明，FGFR2的沉默阻碍了FGF9-NLCs促进神经再生的有益作用。（B） 神经切片的IF染色显示，沉默FGF9-NLC中的FGFR2而非FGFR3可以阻止细胞和轴突之间的相互作用，因此大多数Dil阳性细胞未被S100β染色标记。荧光图像中的比例尺：100μm。
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