Nuclear receptor CAR-ERα signaling regulates the estrogen sulfotransferase gene in the liver

doi:10.1038/s41598-020-61767-9

.2020年3月19日；10(1):5001.

doi:10.1038/s41598-020-61767-9。

核受体CAR-ERα信号调节肝脏雌激素硫转移酶基因

MyeongJin Yi公司¹, Muluneh Fashe公司¹, 荒川信戈¹, 瑞克·莫尔¹, Tatsuya Sueyoshi先生¹, 根岸Masahiko²

附属公司

¹美国北卡罗来纳州三角研究园国立卫生研究院国家环境健康科学研究所生殖和发育生物学实验室药物遗传学科，27709。
²美国北卡罗来纳州三角研究园美国国立卫生研究院环境健康科学研究所生殖与发育生物学实验室药物遗传学科，邮编27709。negishi@niehs.nih.gov。

PMID： 32193417
预防性维修识别码： PMC7081254型
内政部： 10.1038/s41598-020-61767-9

核受体CAR-ERα信号调节肝脏雌激素硫转移酶基因

MyeongJin Yi公司等。科学代表. 2020.

.2020年3月19日；10(1):5001.

doi:10.1038/s41598-020-61767-9。

作者

MyeongJin Yi公司¹, 穆卢内·法什¹, 荒川真吾¹, 瑞克·莫尔¹, Tatsuya Sueyoshi先生¹, 根岸Masahiko²

附属公司

¹美国北卡罗来纳州三角研究园国立卫生研究院国家环境健康科学研究所生殖和发育生物学实验室药物遗传学科，27709。
²美国北卡罗来纳州三角研究园国立卫生研究院国家环境健康科学研究所生殖和发育生物学实验室药物遗传学科，27709。negishi@niehs.nih.gov。

PMID： 32193417
预防性维修识别码：第7081254页
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摘要

雌激素硫转移酶（SULT1E1）使雌激素失活并调节其代谢稳态。虽然SULT1E1在成年小鼠的肝脏中表达较低，但它是由苯巴比妥（PB）治疗或通过核受体在糖尿病肝脏中自发诱导的。利用构成性活性/雄甾烷受体（CAR）KO、雌激素受体α（ERαKO、磷酸化阻断ERαS216A KI小鼠，现在证明，在被PB激活后，CAR结合并招募ERα到Sulte1启动子上，以在Ser216进行后续磷酸化。这种磷酸化加强CAR与ERα的相互作用并激活启动子。1型糖尿病秋田小鼠肝脏SULT1E1 mRNA水平显著上调；在PB诱导的肝脏中观察到，CAR自发积聚在细胞核中，并通过在肝脏中募集磷酸化ERα来激活Sult1e1启动子。因此，这种CAR-磷酸化ERα信号能够使这两个核受体进行通信，激活Sult1e1基因以应对小鼠PB或糖尿病。ERα磷酸化可将CAR整合到雌激素作用中，为理解临床治疗中的药物-激素相互作用提供见解。

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图1
PB在CAR WT和CAR KO雄性中诱导SULT1E1的表达。(一)用PB或PBS处理C57BL/6J雄性肝脏，制备细胞溶胶提取物。PB处理诱导SULT1E1，α-微管蛋白多克隆抗体作为负荷对照。(b条)PBS或PB对CAR野生型和KO小鼠肝脏SULT1E1 mRNA的PB诱导(N个 = 8).P（P）-方差分析得出的值为0.0013。(**c（c）**)从CAR WT中制备肝脏RNA(N个 = 8）和CAR KO(N个 = 8）用PB或PBS治疗24小时的雄性 h.使用与SULT1E1相同的RNA来测量CYP2B10 mRNA的水平第页-四个不同组的数值均小于0.0001。所有数据均以平均值表示 ± 单个小鼠的S.D.值和单向方差分析被用作多组的统计分析。

图2
PB诱导ERαS216A KI和ERαKO雄性中SULT1E1 mRNA的表达。肝脏RNA是从(一)ERα重量(N个 = 8）和ERαS216A KI(N个 = 8）、男性或(b条)ERα重量(N个 = 12）和ERαKO(N个 = 12）用PB或PBS治疗24小时的雄性 h、测量每个SULT1E1 mRNA。每个第页-这两个数据集的值分别为0.0059和<0.0001。相同的RNA样本来自(**c（c）**)ERα重量(N个 = 8）和ERαS216A KI(N个 = 8）、男性或(d日)ERα重量(N个 = 12）和ERαKO(N个 = 12）雄性被用来测量CYP2B10 mRNA第页-数据值估计低于0.0001。所有数据均以平均值表示 ± 单个小鼠值的S.D。ERαS216A KI数据集采用单因素方差分析进行统计分析，ERαKO数据集用Kruskal-Wallis检验进行分析。

图3
PB诱导Ser216磷酸化ERα与*南1e*雄性小鼠的启动子。采用ChIP分析显示ERα与近端*南1e*发起人。(一)扩增区域和用于PCR扩增的引物的示意图。(b条)从用PB或PBS处理6个月的CAR WT和KO雄性的肝脏中制备染色质 h.用ERα抗体或P-S216肽抗体进行ChIP分析。两者都是(**c（c）**,d日)分别显示P-ERα和ERα的量化，量化由输入强度归一化。用ImageJ进行密度测定。统计分析采用Kruskal-Wallis检验和单因素方差分析第页-值分别为0.0004和<0.0001。(**e（电子）**)用PB或PBS处理ERα和KI雄性大鼠肝脏6小时，制备染色质 h.用ERα抗体或P-S216肽抗体对这些染色质进行ChIP分析。使用兔IgG作为阴性对照。两者都是(**（f）**,克)给出了ERα和KI雄性大鼠的P-ERα和ERα的量化数据，这些数据通过输入强度进行了归一化。用ImageJ进行密度测定。统计分析采用Kruskal-Wallis检验和单因素方差分析第页-值分别为0.0064和<0.0001。所有数据均以平均值表示 ± 单个小鼠值的S.D。

图4
CAR与磷酸化ERα之间的相互作用。(一)DR4序列用作凝胶位移分析的探针。(b条)³²如图所示，将P标记的双链探针与从小鼠肝脏制备的核提取物混合。对于超位移，将CAR或磷酸化ERα抗体添加到探针和核提取物的混合物中，如图所述(**c（c）**)FLAG标记的CAR与EYFP标记的ERαWT、ERαS216A和ERαS216D在Huh7细胞中在10 nM 17β-雌二醇24 h.分离全细胞裂解物并用αGFP树脂沉淀，洗脱的蛋白质从中加载到SDS-PAGE凝胶上，并用αFLAG抗体进行染色。全长凝胶图像如补充图3所示。(d日)ERα同二聚体（棕色和洋红单体）和CAR/RXRα异二聚体之间假想异四聚体的3D模型（黄色的CAR和灰色的RXRα）。在这个模型中，CAR的一个表面与RXRα相互作用，而另一个表面则与ERα亚基相互作用。配体（17β-雌二醇（ERα），9-顺式-维甲酸（RXRα），3,5-二氯-2-（4-[（3,5-氯吡啶-2-基）氧]苯氧基）吡啶（CAR））显示为球形原子（氧为红色，氮为蓝色，氯为绿色，碳原子着色为配体结合的蛋白质）。这种核受体四聚体可能包含一种复合物，该复合物调节*南1e*基因。在方法中可以找到模型四聚体是如何创建的描述。

图5
Akita-CAR KO雄性大鼠肝脏SULT1E1的表达。(一)肝脏RNA由C57BL/6J制备(N个 = 10）和秋田(N个 = 10）男性。CYP2B10 mRNA是经典的CAR靶点，与C57BL/6J相比，它在秋田的表达更高。数据集由学生的t吨-测试，以及第页-值小于0.0001。(b条)从C57BL/6J的肝脏中分别制备细胞核提取物(N个 = 3）和秋田(N个 = 3). CAR在细胞核中的表达高于C57BL/6J。(**c（c）**)从CAR WT制备肝脏RNA(N个 = 9）、CAR KO(N个 = 8），秋田(N个 = 9）和Akita-CAR KO(N个 = 6). 数据集通过Kruskal-Wallis检验进行分析第页-值为0.0001。(d日)分别从上述各组的三个肝脏中制备染色质，用于随后的ChIP分析。两者都是(**e、（f）**)给出了P-ERα和ERα的量化数据，这些数据通过输入强度进行了归一化。用ImageJ进行密度测定。所有数据均以平均值表示 ± 单个小鼠的S.D.值和单向方差分析用作统计分析。每个第页-两组数值均小于0.0001。

图6
非磷酸化ERα不与*南1e*P-RORα雄性小鼠的启动子。ChIP分析用于显示RORα与近端的结合*南1e*发起人。(一)用RORα抗体或P-S100肽抗体进行ChIP分析，从ERαWT和KI雄性的肝脏中制备染色质。两者都是(b条,**c（c）**)分别表示P-RORα和RORα的数据量化，并通过输入强度进行归一化。通过ImageJ检查该测定，并使用单因素方差分析作为统计分析，以及第页-值分别为0.0247和0.1080。(d日)V5-CAR WT（无标记）与FLAG标记的RORαWT、RORαS100D、EYFP标记的ERαWT和ERαS216D在Huh7细胞中共同表达。分离全细胞裂解物并用αGFP-树脂沉淀，将洗脱的蛋白质装载在SDS-PAGE凝胶上，并用α-GFP-或αFLAG抗体进行染色。

图7
CAR-ERα通信机制的示意图。在Thr38磷酸化的CAR通过表面a形成同型二聚体，并在细胞质中保持不活跃^,作为对PB的反应，Thr38脱磷酸化而非磷酸化的CAR同型二聚体解离，使DBD和LBD之间的相互作用转移到细胞核中^,在细胞核中，CAR利用其表面B形成RXRα-CAR异二聚体。雌激素结合后，ERα通过B表面二聚化。随后，RXRα-CAR异二聚体招募ERα同二聚体到*苏尔特1*异二聚体结合的CAR和同二聚体连接的ERα之间的启动子通过它们的A曲面。虽然磷酸化的ERα不能直接结合DNA，但其同二聚体夹在RXRα-CAR异二聚体和磷酸化的RORα之间，从而激活启动子。

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