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.2020年3月16日；12(3):703.
doi:10.3390/cancers12030703。

脱甲氧基姜黄素对p38 MAPK-HO-1轴和cIAP1/XIAP的双重靶向作用触发Caspase介导的口腔鳞状细胞癌细胞凋亡

Ming-Hsien Chien先生 1 2 三 4, 魏恩阳 5 6, 杨依洁 1 7, 恰池库 1, 李维久 8 9, 蔡梦英 5 6, 乔文林 10 11, 杨顺发 5 6
附属公司

脱甲氧基姜黄素双重靶向p38 MAPK-HO-1轴和cIAP1/XIAP触发Caspase介导的口腔鳞癌细胞凋亡

Ming-Hsien Chien先生等。 癌症（巴塞尔）. .

摘要

脱甲氧基姜黄素（DMC）是一种姜黄素类似物，在口服后具有比姜黄素更好的稳定性和更高的水溶性，并且具有治疗多种癌症的潜力，包括口腔鳞癌（OSCC）。本研究的目的是研究DMC对OSCC的抗癌作用及其机制。我们发现DMC通过同时诱导G2/M期阻滞和细胞凋亡抑制细胞增殖。机制研究发现，细胞IAP 1（cIAP1）/X染色体连锁IAP（XIAP）的下调和血红素氧化酶1（HO-1）的上调对于DMC诱导的caspase-8/-9/-3活化和凋亡细胞死亡至关重要。此外，DMC处理OSCC细胞后，p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和c-Jun N-末端激酶（JNK）1/2被激活，只有p38 MAPK的抑制才能显著消除DMC诱导的HO-1表达和胱天蛋白酶8/-9/-3的激活。临床数据集分析显示，HO-1高表达和cIAP1低表达的头颈癌患者预后最好。此外，DMC与表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的联合治疗显著增强了吉非替尼对OSCC细胞增殖的抑制作用。总的来说，目前的研究支持DCM通过抑制IAP和激活p38-HO-1轴作为OSCC治疗方法的一部分发挥作用。

关键词：细胞凋亡；脱甲氧基姜黄素；血红素氧化酶-1；凋亡抑制蛋白；口腔鳞状细胞癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
脱甲氧基姜黄素（DMC）通过诱导G2/口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞的M期阻滞。(A类)DMC的化学结构。(B类)将两个OSCC细胞系SCC-9和HSC-3以及一个正常牙龈上皮细胞系SG用指定浓度的DMC（12.5、25和50μM）或DMSO（载体对照）处理24 h，并进行噻唑蓝四唑溴化铵（MTT）检测以确定细胞活性*第页与DMSO治疗组相比，<0.05#第页与OSCC细胞相比，<0.05。(C类)用OSCC细胞处理载体或DMC（12.5–50μM）24小时后，改变培养基以去除DMC，并将SCC-9和HSC-3细胞分别在新鲜培养基中维持18天和7天，以确定DMC的长期死亡诱导作用。左侧面板显示了具有代表性的显微照片。数据以半对数形式给出，作为存活分数/DMC剂量图。(D类)用SCC-9和HSC-3细胞处理载体或DMC（12.5-50μM）24小时后，细胞周期相分布和细胞死亡在亚G1碘化丙啶（PI）染色后用FACS分析相位。(E类)图表总结了细胞周期结果。
图1
图1
脱甲氧基姜黄素（DMC）通过诱导G2/口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞的M期阻滞。(A类)DMC的化学结构。(B类)将两个OSCC细胞系SCC-9和HSC-3以及一个正常牙龈上皮细胞系SG用指定浓度的DMC（12.5、25和50μM）或DMSO（载体对照）处理24 h，并进行噻唑蓝四唑溴化铵（MTT）检测以确定细胞活性*第页与DMSO治疗组相比，<0.05#第页与OSCC细胞相比，<0.05。(C类)用OSCC细胞处理载体或DMC（12.5–50μM）24小时后，改变培养基以去除DMC，SCC-9和HSC-3细胞分别在新鲜培养基中保存18和7天，以确定DMC的长期死亡诱导作用。左侧面板显示了具有代表性的显微照片。数据以半对数形式给出，作为存活分数/DMC剂量图。(D类)用SCC-9和HSC-3细胞处理载体或DMC（12.5–50μM）24小时后，亚G细胞的细胞周期相分布和细胞死亡1碘化丙啶（PI）染色后用FACS分析相位。(E类)图表总结了细胞周期结果。
图2
图2
脱甲氧基姜黄素（DMC）诱导口腔鳞癌（OSCC）细胞凋亡。(A类)在24 h DMC（25μM）处理SCC-9和HSC-3细胞后，Hoechst 33342染色后用荧光显微镜分析凋亡的形态学特征。红色箭头表示作为凋亡指标的核碎裂和浓缩。(B类,C类)用Annexin-V和碘化丙啶（PI）双染色流式细胞术定量分析用DMC（12.5-50μM）或载体处理24小时的SCC-9和HSC-3细胞的细胞凋亡。两种细胞的一个代表性示例显示在B中。值表示三个独立实验的平均值±SD(C类). *第页< 0.05, **第页与车辆组相比，<0.01。
图3
图3
口腔鳞癌（OSCC）细胞中由脱甲氧基姜黄素（DMC）调控的凋亡相关蛋白的高通量筛选。(A类（左面板）显示了载体和DMC处理的HSC-3细胞凋亡蛋白阵列（R&D系统）的代表性图像。(A类（右面板）使用密度计对参与凋亡和调节途径的蛋白质进行定量，并表示为与对照组相比变化的倍数。(B类——G公司)用指定浓度的DMC处理HSC-3细胞24 h，用Western blot分析检测血红素氧化酶（HO）-1、细胞凋亡抑制因子1（cIAP1）、X染色体连锁IAP（XIAP）、前半胱天冬酶-3、-8和-9以及聚ADP-核糖聚合酶（PARP）的表达水平(B类,D类,F类). β-肌动蛋白水平用于调整这些蛋白水平的定量结果，并表示为超出各自对照的诱导倍数。数值表示为三个独立实验的平均值±SD*第页<0.05，与车辆组相比(C类,E类,G公司).
图4
图4
血红素加氧酶（HO）-1是一种上游调节因子，参与脱甲氧基姜黄素（DMC）诱导的caspase激活以及随后诱导口腔鳞癌（OSCC）细胞凋亡。(A类——D类)用HO-1特异性siRNA或对照siRNA（siCtrl）瞬时转染HSC-3细胞，并进行Western blot和MTT分析。HO-1 siRNA的敲除效率如A.HO-1特异性siRNA逆转了DMC诱导的裂解caspase-3、-8和-9的增加(B类,C类)细胞增殖减少(D类)HSC-3细胞。数据表示为三个独立实验的平均值±SD*第页与车辆组相比，<0.05；# 第页与siCtrl转染组相比，<0.05。(E类)HO-1的酶活性对于DMC在OSCC细胞中的促凋亡作用至关重要。在存在或不存在HO-1酶抑制剂SnPP（5μM）的情况下，用DMC处理SCC-9细胞24 h，并通过Western blotting分析分析裂解caspase-3的表达。(F类)DMC和铁原卟啉IX（FePP）/血红素联合处理对OSCC细胞活力的影响。同时用DMC（50μM）和FePP（25或50μM。列，平均值(n个= 3); 巴，标准偏差***第页与车辆组相比<0.001。# 第页与仅DMC治疗组相比，<0.05。ns：不显著。(G公司)mRNA水平的表达HMOX1型正常组织中的（FPKM）(n个=44）和原发性头颈部肿瘤(n个= 520). (H（H）)的相关性HMOX1型Kaplan–Meier分析在头颈部鳞状细胞癌中的表达和总生存率（OS）。(我)用指示浓度的DMC处理SG细胞24小时，并用Western blot分析检测HO-1的表达水平。(J型)所有患者被分为负相关HMOX1型和BIRC2公司表达式，低HMOX1型和高BIRC2公司（H0B1），高HMOX1型和低BIRC2公司（H1B0）等。数据显示H1B0组患者预后最为良好（总体第页-值0.028）。在阴性相关组中，H0B1组患者的预后比H1B0组患者差(第页= 0.01). 头颈部癌症数据集取自癌症基因组图谱（TCGA）。
图5
图5
p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径参与脱甲氧基姜黄素（DMC）介导的血红素加氧酶（HO）-1表达和细胞凋亡的诱导。(A类,B类)HSC-3细胞暴露于载体或DMC（12.5-50μM）24小时；然后，用Western blot分析细胞外信号调节激酶（ERK）1/2、c-Jun N末端激酶（JNK）1/2和p38的磷酸化状态(A类). 磷酸化-MAPK的定量结果，调整为总MAPK，并表示为超出各自对照的诱导倍数(B类). 数据表示为三个独立实验的平均值±SD*第页与车辆组相比，<0.05。(C类,D类)用SB203580（10μM）或c-Jun N末端激酶（JNK）in-8（1μM）预处理HSC-3细胞1 h，然后再进行24 h载体或DMC（50μM）处理。通过Western blot分析分析裂解caspase-3、-8和-9以及HO-1的水平(C类). 使用Image-pro-plus处理软件对归一化为β-肌动蛋白的蛋白质印迹进行定量(D类). 数据表示为三个独立实验的平均值±SD*第页与车辆组相比，<0.05；# 第页与DMC治疗组相比。
图5
图5
p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路参与脱甲氧基姜黄素（DMC）介导的血红素加氧酶（HO）-1表达诱导和细胞凋亡。(A类,B类)HSC-3细胞暴露于载体或DMC（12.5-50μM）24小时；然后，用Western blot分析细胞外信号调节激酶（ERK）1/2、c-Jun N末端激酶（JNK）1/2和p38的磷酸化状态(A类). 磷酸化-MAPK的定量结果，调整为总MAPK，并表示为超出各自对照的诱导倍数(B类). 数据表示为三个独立实验的平均值±SD*第页与车辆组相比，<0.05。(C类,D类)用SB203580（10μM）或c-Jun N末端激酶（JNK）in-8（1μM）预处理HSC-3细胞1 h，然后再进行24 h载体或DMC（50μM）处理。通过Western blot分析分析裂解caspase-3、-8和-9以及HO-1的水平(C类). 使用Image-pro-plus处理软件对标准化为β-肌动蛋白的蛋白质印迹进行定量(D类). 数据表示为三个独立实验的平均值±SD*第页与车辆组相比，<0.05；# 第页与DMC治疗组相比，<0.05。
图6
图6
一个工作模型显示了脱甲氧基姜黄素（DMC）抑制口腔鳞癌（OSCC）细胞生长的分子机制。DMC对来源于原发和转移部位的OSCC细胞的抗增殖活性归因于抑制细胞凋亡抑制因子1（cIAP1）/X染色体连锁IAP（XIAP）的表达和激活p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）-血红素加氧酶（HO）-1轴，最终诱导凋亡细胞死亡。此外，诱导G2/M期阻滞可能是DMC诱导OSCC细胞凋亡的另一个原因。
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