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.2020年2月10日；16(7):1252-1263.
doi:10.7150/ijbs.38835。 eCollection 2020。

EHMT2/G9a通过抑制自噬激活抑制主动脉平滑肌细胞死亡

陈泰强 1, 南湖 2, 博霍 1, 杰克逊·费迪南德·马索 1, 辛毅（Xin Yi） 3, 肖传忠 1, 陈勇杰 1, Xian Guo公司 1, 朱学海 1 4 5 6, 向伟 1 4 5 6, 丁胜江 1 4 5 6
附属公司

EHMT2/G9a通过抑制自噬激活抑制主动脉平滑肌细胞死亡

陈泰强等。 国际生物科学杂志. .

摘要

尽管EHMT2（也称为G9a）在几种癌症和心脏重塑中起着关键作用，但其在血管平滑肌细胞（VSMC）中的功能尚不清楚。在本研究中，我们揭示了EHMT2在调节VSMC自噬细胞死亡（ACD）中的新功能。BIX01294抑制EHMT2或敲除EHMT2导致VSMC数量减少，与增殖和凋亡无关。有趣的是，经自噬诱导剂治疗的VSMC中EHMT2蛋白水平显著降低。此外，在用BIX01294或慢shEHMT2处理的VSMCs中检测到比其对应物更多的自噬液泡和积累的LC3II。此外，我们发现EHMT2通过抑制自噬体的形成来抑制VSMC的ACD。从机制上讲，EHMT2抑制引起的促自噬作用与SQSTM1和BECN1过表达有关。此外，SQSTM1或BECN1击倒在很大程度上消除了这些有害影响。更重要的是，在原代人主动脉VSMC中也观察到类似的结果。总的来说，这些发现表明EHMT2通过降低SQSTM1或BECN1的表达而发挥ACD的关键负调控作用，并且EHMT2可能是心血管疾病的有效治疗靶点(例如。，主动脉夹层）。

关键词：自噬；BECN1；EHMT2/G9a；SQSTM1；血管平滑肌细胞。

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竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
EHMT2抑制或敲除抑制RAVSMC生长。答：。用不同浓度的BIX01294处理24小时（n=4个样品）的RAVSMC中H3K9me1、H3K9 me2和组蛋白H3的代表性western blot，组蛋白H4作为负荷对照。B。用BIX01294或DMSO处理24小时后，通过LDH释放评估细胞损伤（n=6）*第页<0.05与DMSO。C、。用5μM的BIX01294或DMSO（n=3）处理后，在指定的时间点计算细胞数*第页<0.05与DMSO。D。BIX01294（5μM）或DMSO处理（n=4）后不同时间点的光学显微镜下代表性细胞图像。E.公司。western blot检测感染lent-shRNA或lent-EHMT2（n=4）的RAVSMC中EHMT2、H3K9me1、H3K9me2和组蛋白H3蛋白水平，组蛋白H4作为负荷对照。F、。用lent-shRNA或lent-EHMT2处理RAVSMC指定时间的生长曲线（n=3）*第页<0.05 vs.lent-shRNA。G.公司。RAVSMC在光学显微镜下的代表性图像（n=4）。
图2
图2
在自噬相关刺激下，EHMT2蛋白水平降低。答：。用western blot检测150 nM雷帕霉素处理24小时或48小时（n=4）的RAVSMC中EHMT2和组蛋白H3的蛋白水平*第页<0.05与DMSO。B。采用Western blot检测氨基酸缺失与否（n=4）条件下RAVSMC中EHMT2和组蛋白H3的蛋白水平*第页<0.05与对照组。C、。用western blot检测FBS剥夺与否刺激的RAVSMC中EHMT2和组蛋白H3的蛋白水平（n=4）*第页<0.05与对照组。组蛋白H3用作负载对照。
图3
图3
EHMT2抑制或敲除加速RAVSMC自噬。答：。经5μM的BIX01294或DMSO处理48h（n=3）后，RAVSMC用α-SMA荧光染色，红色箭头表示VSMC中有空泡。B。透射电镜下自噬空泡的代表性图像和黄色箭头表示RAVSMCs在5μM BIX01294或DMSO刺激12小时（比例尺，1μM）后的自噬空泡。C、。western blot检测5μM BIX01294处理不同时间（n=4）的RAVSMC中LC3和组蛋白H3蛋白水平。D。通过western blot评估经指示刺激（n=4）处理的RAVSMC中LC3和组蛋白H3的蛋白水平。E.公司。mCherry-GFP-LC3在RAVSMC中过度表达，随后用5μM BIX01294或DMSO刺激RAVSMC 6小时。黄色和红色分别表示自噬体或自溶体（n=3）。F、。用western blot检测感染lent-shRNA或lent-shEHMT2的RAVSMC（n=4）中LC3和组蛋白H3的蛋白水平。G.公司。Western blot用于评估经指示刺激8h（n=4）处理的RAVSMC中LC3和组蛋白H3的蛋白水平。组蛋白H3用作负荷控制。
图4
图4
EHMT2直接抑制SQSTM1和BECN1的表达，以抑制RAVSMC的自噬死亡。A和B。RAVMSC中的SQSTM1和BECN1蛋白水平（A）5μM BIX01294或DMSO或以下（B）western blot评价lent-shRNA或lent-shEHMT2治疗（n=4）。组蛋白H3用作负荷控制。C、。ChIP-PCR检测用5μM BIX01294或DMSO（n=3）处理的RAVSMC中，H3K9me1在SQSTM1和BECN1启动子上的富集*第页<0.05与DMSO。D和F。BIX01294和lent-shSQSTM1处理的RAVSMC的生长曲线（D）或用BIX01294和lent-shBECN1处理（F）（n=3）。E和G。western blot检测经指示刺激（n=4）处理的RAVSMC中LC3蛋白水平，组蛋白H3作为负荷控制。
图5
图5
EHMT2通过调节SQSTM1和BECN1的表达抑制原发性HAVSMC的自噬死亡。答：。BIX01294刺激原代HAVSMC的生长曲线达到指定时间（n=3）*第页<0.05与DMSO。B。通过western blot评估经BIX01294或DMSO处理24h（n=4）的原发性HAVSMC中SQSTM1、BECN1和LC3的蛋白水平。C、。EHMT2基因敲除或其对应物（n=4）的主要HAVSMC中的H3K9me1、H3K9 me2、SQSTM1、BECN1和LC3蛋白水平。D。经指示刺激处理的初级HAVSMC的生长曲线（n=3）*p<0.05 vs.lent-shRNA+BIX01294。E和F。在用指示刺激处理的原发性HAVSMCs中通过蛋白质印迹检测LC3蛋白水平（n＝4）。组蛋白H3用作负荷控制。
图6
图6
示意图概要。我们的结果表明，在自噬诱导剂治疗下，EHMT2蛋白水平下调。BIX01294抑制EHMT2或lent-shEHMT2击倒EHMT2可通过直接增加SQSTM1和BECN1的表达，促进VSMC中自噬体的形成，进而加速VSMC的自噬细胞死亡。
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