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.2020年3月3:9:e52570。
doi:10.7554/eLife.52570。

p16缺乏通过调节氧化应激和髓核细胞周期减轻椎间盘退变

慧车 # 1 2, 李杰（音译） # 三, 尤莉（You Li） 1, 程马 1, 刘欢 1 4, 秦静怡 5, 董江辉 6 7, Zhen Zhang先生 6, 科里J西安 7, 苗登顺 8, 王丽萍 6 7, 任永新 1
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p16缺乏通过调节氧化应激和髓核细胞周期减轻椎间盘退变

慧车等。 埃利夫. .

摘要

细胞周期调节器p16被称为生物标记物和衰老效应器。然而，其在椎间盘退变（IVDD）中的作用尚不清楚。在这项研究中，发现p16的表达水平与人类IVDD的严重程度呈正相关。在小鼠尾部悬吊（TS）诱导的IVDD模型中，p16缺失在很大程度上挽救了腰椎间盘高度指数和基质蛋白表达水平的显著降低。在TS小鼠椎间盘中，活性氧水平、衰老细胞比例和衰老相关分泌表型（SASP）均增加，细胞周期延迟，Sirt1、超氧化物歧化酶1/2、细胞周期素依赖激酶4/6、磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白、，和转录因子E2F1/2。然而，p16缺失挽救了这些影响。我们的结果表明，p16在IVDD发病机制中起着重要作用，其缺失通过促进细胞周期和抑制SASP、细胞衰老和氧化应激来减弱IVDD。

关键词：细胞周期；细胞增殖；人；人类生物学；免疫学；炎症；椎间盘退变；药物；小鼠；氧化应激；第16页。

简明扼要的语言总结

随着岁月的流逝，许多人都会遇到颈肩痛、腰痛和腿部麻木的情况。这是因为椎间盘，即脊椎骨之间的填充结构，随着年龄的增长而退化：他们的细胞进入“衰老”、不活动状态，并停止增殖。已知一种称为p16的蛋白质在衰老细胞中积累，p16是细胞生长和分裂的重要调节因子。事实上，在小鼠脂肪组织、肌肉或眼睛中，去除含有高水平p16的细胞可以延缓与衰老相关的疾病。然而，失活衰老细胞中编码p16的基因是否能延缓椎间盘退变尚不清楚。Che，Li等人在这里发现，p16在严重退化的人类椎间盘的衰老细胞中高度存在。髓核是椎间盘中最关键的凝胶状组织，髓核中的细胞是在实验室中提取并生长的，条件是复制脊椎早期损伤的情况。然后使用药物和基因操作来减少这些细胞中p16的数量。实验表明，降低p16的水平会导致衰老细胞增殖更多，显示出更少的损伤和老化迹象。此外，与处于类似条件下的“正常”小鼠相比，p16编码基因被删除的小鼠椎间盘不太容易退化。总的来说，Che，Li等人的研究表明，抑制椎间盘细胞中的p16可以延缓衰老过程并减少椎间盘退变。这些发现可能有一天适用于椎间盘疾病患者，例如，他们可能会从针对产生p16的细胞的基因治疗中受益。

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数字

图1。
图1.不同程度退化的人类舌间盘NP细胞中p16的表达（根据Pfirrmann分级，G2–G5组）。
(A类)H和E染色的代表性图像显示了细胞/组织的一般形态。藏红O染色，胶原和NP细胞呈橙色，纤维呈蓝色/紫色。Masson染色，胶原和NP细胞呈蓝色，纤维呈红色；p16免疫组化染色(B类)p16阳性细胞的定量（%）。p16蛋白水平通过(C类)western印迹和(D类)通过密度分析测量，并表示为相对于2级（G2）NP样品的折叠。数据表示为平均值±SD（n=3）；*p<0.05**p＜0.01。
图1——图补充1。
图1-图补充1。根据Pfirrmann分级对不同类型椎间盘退变患者进行代表性磁共振成像（MRI）扫描。
2-5年级：G2-5。黄色箭头表示手术部位。
图1—图补充2。
图1补充图2。人类标本退变椎间盘的Pffirmann分级与p16表达单独相关***p<0.001。
图2。
图2：p16对衰老、活性氧（ROS）水平和NP细胞增殖对IL-1β刺激的影响（10 ng/mL）。
人NP细胞分为正常培养细胞（对照组）、IL-1β处理细胞（IL-1β）、经IL-1β（IL-1α+siRNA）处理的p16-siRNA-转染细胞和经IL-1α（IL-1γ+p16）处理的质粒转染细胞。(A类)代表性的p16免疫荧光显微镜染色。(B类)通过western blotting评估p16蛋白水平。(C类)通过CCK-8分析评估细胞增殖。(D类)SA-β-半乳糖染色。(E类)p16阳性和β-半乳糖阳性细胞总数（%）。(F类)流式细胞术测定新鲜收集的人类NP细胞的ROS水平和细胞周期分布。(G公司)活性氧水平的定量。(H（H）)p16水平通过密度分析测量，并相对于对照表达。(我)细胞周期分布。数据表示为平均值±SD（n=3）*p＜0.05**p<0.01***p<0.001。
图2——图补充1。
图2-图补充1.用p16 siRNA和p16质粒转染的效率与用空siRNA和空质粒转染的效率相比。
(A类)对空siRNA、p16 siRNA、空质粒和p16质粒进行染色的典型免疫荧光显微照片。(B类)p16阳性细胞总数（%）。转染无siRNA和P16 siRNA的NP细胞之间，或转染空质粒和P16质粒的NP电池之间，P16的表达存在显著差异。数据表示为平均值±SD（n=3）*p<0.05。
图3。
图3雷帕霉素（50 nM）对衰老、活性氧（ROS）水平和NP细胞增殖的影响（10 ng/mL）。
人NP细胞分为正常培养细胞（对照）、IL-1β处理细胞（IL-1β）和用IL-1β（IL-1α+rapa）处理的雷帕霉素刺激细胞。(A类)p16染色的代表性免疫荧光显微照片。p16蛋白水平(B类)通过western blotting和(C类)通过密度分析测量，结果表示为相对于对照。(D类)活性氧水平的定量。(E类)SA-β-半乳糖染色。(F类)p16阳性和β-半乳糖阳性细胞总数（%）。(G公司)流式细胞术测定新鲜收集的人类NP细胞的ROS水平和细胞周期分布。(H（H）)细胞周期分布。(我)通过CCK-8测定评估的细胞增殖。数据表示为平均值±SD（n=3）*p＜0.05**p<0.01***p<0.001。
图4。
图4.p16缺失延迟小鼠椎间盘退变（IVDD）。
WT和p16 KO小鼠在地面或尾部悬吊（TS）喂养。(A类)小鼠全长的射线照片。(B类)H、E染色和藏红O染色后，胶原和NP细胞呈橙色，纤维呈蓝色。(C类)根据腰椎计算的椎间盘高度指数。(D类)通过western blotting和(E类)通过密度分析测量，结果与WT小鼠的结果相对应。(F类)通过RT-PCR相对于GAPDH表达评估靶mRNA表达。(G公司)ELISA法测定椎间盘组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。(H（H）)根据腰椎间盘信号评估的改良Thompson分类。(我)藏红O阳性面积（%）。数据以平均值±标准差（n=3）表示*p＜0.05**p<0.01***p<0.001。
图4——图补充1。
图4-图补充1.TS诱导的小鼠IVDD模型的建立。
(A类)一种专门用来悬挂老鼠尾巴的笼子。老鼠可以在笼子里自由获取食物和水。(B类)悬浮4周后处死小鼠。脊椎周围的肌肉充血，有不同程度的损伤。尾部悬吊（TS）导致肌肉明显充血，p16 KO缓解了这种情况。
图4——图补充2。
图4-图补充2.小鼠椎间盘的代表性显微MRI。
椎间盘的白色区域越大，所含水分越多，这与椎间盘退变的程度呈正相关。黄色箭头表示光盘站点。
图4——补充图3。
图4补充了小鼠标本中退化椎间盘的Pffirmann等级。
*p<0.05***p<0.001。
图4——补充图4。
图4-补充图4。通过平均从(A类)后部(B类)中间，和(C类)椎间盘前部，并将这些值除以相邻椎间盘的平均高度(D–I型)椎体的后部、中部和前部。
图5。
图5.p16缺失产生抗氧化作用并促进小鼠体内NP细胞增殖。
WT和p16 KO小鼠在地面或尾部悬吊（TS）喂养。(A类)免疫组织化学染色8-羟基-2脱氧鸟苷（8-OHdG）、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）、Ki67和增殖细胞核抗原（PCNA）的切片代表性显微照片。(B类)用流式细胞术测定新收集的小鼠NP细胞中的活性氧（ROS）水平、细胞增殖（PRL）和细胞周期分布。(C类)通过western blotting和(D、， E类)通过密度分析进行测量，结果与WT小鼠的结果相对应。(F类)免疫阳性细胞总数的百分比（%）。(G公司)通过RT-PCR相对于GAPDH表达评估靶mRNA表达。(H（H）)细胞周期分布。(我)ROS和PRL（%）定量。数据以平均值±SD表示（n=3）*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6。
图6 NF-κB-65结合CDKN2A型基因启动子和促进p16在人NP细胞中的表达。
(A类)CDKN2A型通过PCR从p65免疫沉淀物中恢复启动子序列。(B类)人体中的p65类元素CDKN2A型启动子区域和突变序列用红色标记（上部面板）。 下面：WT和突变型pGL4.23-p16启动子报告质粒的结构示意图。(C类)萤光素酶活性由CDKN2A型NF-κB处理后，启动子更加明显。相比之下，荧光素酶活性不受CDKN2A型NF-κB缺失时荧光素酶报告子下降，荧光素素酶活性不受突变体驱动CDKN2A型NF-κB处理后荧光素酶报告子下降。数据以平均值±SD表示（n=3）***p<0.001。
图6——图补充1。
图6-图补充1。NF-κB-p65中的另一个位点被预测与CDKN2A型发起人。
(A类)通过PCR从p65免疫沉淀物中恢复了p16启动子序列，但未从免疫前IgG免疫沉淀素中恢复。(B类)人体中的p65类元素CDKN2A型启动子区域和突变序列以红色突出显示（上部面板）。 下面：pGL4.23-p16启动子报告质粒和突变型pGL4.23-4启动子报告载体的结构示意图。(C类)荧光素酶活性由CDKN2A型在NF-κB治疗后更显著，但在CDKN2A型荧光素酶报告子未经NF-κB处理。NF-κB处理后，荧光素酶活性在CDKN2A型荧光素酶报告子发生突变。数据表示为平均值±SD（n=3）；*p<0.05。
图7。
图7：p16调节椎间盘退变（IVDD）机制的拟议模型。
NF-κB-65激活p16表达。p16缺乏可减轻活性氧（ROS）水平、衰老相关分泌表型（SASP）和细胞衰老。随后，p16缺乏促进细胞抗氧化活性，以及ECM的增殖和稳定性，如聚集蛋白和II型胶原。所有途径最终都能防止IVDD的发展。
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