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.2020年2月6日11:43。
doi:10.3389/fgene.2020.00043。 eCollection 2020。

H3K9去甲基化诱导的R环积累与无组织核仁相连

附属公司

H3K9去甲基化诱导的R环积累与无组织核仁相连

洪州等。 前Genet. .

摘要

核仁的结构和完整性对核仁的一系列细胞功能很重要。研究表明,缺乏组蛋白H3赖氨酸9(H3K9)甲基化的细胞形成碎片核仁。然而,所涉及的分子机制尚不清楚。在这里,我们提供的证据表明,H3K9二甲基化(H3K9me2)的缺失会触发rDNA位点的R-loop积累,从而进一步导致多叶核仁。我们发现,抑制剂BIX 01294抑制H3K9甲基转移酶G9a会导致rDNA区域的R环积聚,并诱导多核仁的形成。SiRNA-介导的RNase H1的敲除可水解R-loop中的RNA链,导致R-loop形成增加,进而导致一个核中的多个核仁,而H3K9me2水平不受R-loop积累的影响。小分子抑制剂对RNA聚合酶I转录延伸的抑制导致H3K9me2水平显著降低,rDNA位点的R环积累和核仁断裂。这些结果为H3K9me2通过调节R环积累在核仁结构完整性和组织中的作用提供了一种机制性见解。

关键词:H3K9二甲基化;R回路;多核仁;核糖体DNA;转录抑制。

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图1
图1
G9a抑制剂BIX对HeLa细胞核仁的影响。(A)BIX处理48 h后HeLa细胞中H3K9me2的Western blot分析。(B)人类rRNA基因和分析的扩增子位置的示意图。(C)经BIX或不经BIX处理48小时后,HeLa细胞rDNA区域H3K9me2水平的ChIP分析-轴表示实验组HeLa细胞中rDNA的相对数量与对照组HeLa细胞中rDNA的相对数量之比。这个x个-轴表示rDNA扩增子的不同区域。将相对值归一化为总H3的相对值。(D)HeLa细胞与5μM或10μM BIX孵育48 h,然后用抗纤维蛋白抗体间接免疫荧光染色检测核仁。比例尺=3μm。(E)分别使用或不使用5μM或10μM BIX治疗48小时后,具有三个以上碎片核仁的间期细胞核百分比。每组评估的细胞核数为300个。(F)用Ag-NOR染色检测经BIX或不经BIX处理48 h后HeLa细胞的核仁结构。比例尺=3μm。数据表示为*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)<0.001,由-测试。
图2
图2
RNase H1敲低对HeLa细胞R环和核仁的影响。(A)Western blot检测RNase H1的敲除效率。(B)核糖核酸酶H1短干扰RNA(siRNase H1)转染48小时后HeLa细胞rDNA区域R环的ChIP分析-轴表示实验组HeLa细胞中rDNA的相对数量与对照组HeLa细胞中rDNA的相对数量之比。这个x个-轴表示rDNA扩增子的不同区域。将相对值归一化为输入值。每个实验重复三次,并显示平均值和SD。(C)用阴性对照siRNA(NC)或siRNase H1转染HeLa细胞48 h,然后用抗纤维蛋白抗体间接免疫荧光染色检测核仁。比例尺=3μm。(D)用siRNase H1转染48小时后,间期细胞核中含有三个以上片段核仁的百分比。每组评估的细胞核数为300个。数据表示为*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)<0.001,由-测试。
图3
图3
HeLa细胞rDNA位点上H3K9me2与R环的关系分析。(A)ChIP分析显示,转染siRNase H1 48 h后,rDNA区域组蛋白H3K9me2和R环的水平-轴表示实验组HeLa细胞中rDNA的相对数量与对照组HeLa细胞中rDNA的相对数量之比。这个x个-轴表示rDNA扩增子的不同区域。将H3K9me2的相对值归一化为总H3的相对值,并将R环的相对值标准化为输入值。每个实验重复三次,并显示平均值和SD。(B)在用或不用BIX处理48小时后,对HeLa细胞中的R环和rDNA区域的H3K9me2水平进行ChIP分析。每个实验重复三次,并显示平均值和SD。数据表示为*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)<0.001,由-测试。
图4
图4
ActD处理后HeLa细胞rDNA位点表观遗传修饰的变化。(A)HeLa细胞经或不经ActD处理24 h,然后用抗纤维蛋白抗体间接免疫荧光染色检测核仁。比例尺=3μm。(B)用或不用ActD治疗后具有三个以上碎片核仁的间期细胞核的百分比。每组评估的细胞核数为300个。(C)使用或不使用ActD治疗后,对HeLa细胞rDNA区域的H3K9ac、H3K9 me2和H4K5ac水平进行ChIP分析。这个-轴表示实验组HeLa细胞中rDNA的相对数量与对照组HeLa细胞中rDNA的相对数量之比。这个x个-轴表示rDNA扩增子的不同区域。将相对值归一化为总H3的相对值。每个实验重复三次,平均值用SD表示。数据表示为*P(P)< 0.05, ***P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)<0.001,由-测试。
图5
图5
不同时间点用ActD治疗后HeLa细胞rDNA区域核仁和组蛋白修饰紊乱的分析。(A)在不同时间点,未使用或使用ActD治疗后具有三个以上碎片核仁的间期细胞核百分比。每组评估的细胞核数为300个。(B)用ChIP分析不同时间点用或不用ActD处理后HeLa细胞rDNA区域的H3K9me2水平。这个-轴表示实验组HeLa细胞中rDNA的相对数量与对照组HeLa细胞中rDNA的相对数量之比。这个x个-轴表示rDNA扩增子的不同区域。(C)ChIP分析不同时间点无ActD或有ActD治疗后HeLa细胞rDNA区域H3K9ac水平。将相对值归一化为总H3的相对值。每个实验重复三次,平均值用SD表示。数据表示为*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)<0.001,由-测试。
图6
图6
用Pol I转录抑制剂处理后,HeLa细胞中R-环的积累和定位。(A)ActD处理0.5 h、1 h和24 h后HeLa细胞rDNA区域R环的ChIP分析-轴表示实验组HeLa细胞中rDNA的相对数量与对照组HeLa细胞中rDNA的相对数量之比。这个x个-轴表示rDNA扩增子的不同区域。将相对值归一化为输入值。每个实验重复三次,平均值用SD表示。(B)用抗纤维素酶抗体(FC,红色)和抗R环抗体(S9.6,绿色)在ActD处理的Hela细胞的间期细胞核中通过间接免疫荧光染色检测核仁和R环。数据表示为*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)<0.001,由-测试。
图7
图7
RNase H1过度表达对ActD诱导HeLa细胞核仁分裂的影响。(A)Western blot检测RNase H1过表达质粒的效率。NC代表用空质粒转染的样本。Over-RNase H1代表转染pcDNA3.0-RNase H2的样本。(B)转染RNase H1过表达质粒后HeLa细胞rDNA区域R环的ChIP分析。这个-轴表示实验组HeLa细胞中rDNA的相对数量与对照组HeLa细胞中rDNA的相对数量之比。这个x个-轴表示rDNA扩增子的不同区域。将相对值归一化为输入值。每个实验重复三次,平均值用SD表示。(C)使用或不使用ActD治疗24小时后,间期细胞核有三个以上碎片核仁的百分比。每组评估的细胞核数量为300个。(D)用抗纤维蛋白抗体通过间接免疫荧光染色检测核仁。比例尺=3μm。每个实验重复三次,平均值用SD表示。数据表示为*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)<0.001,由-测试。
图8
图8
ActD和BIX处理对rDNA转录起始的影响。(A)qRT-PCR检测ActD作用24 h后HeLa细胞中5′ETS不完全转录物和成熟rRNA的表达。(B)采用qRT-PCR检测BIX处理48 h后HeLa细胞中不完整的5′ETS转录物和成熟rRNA的表达。表达值归一化为基因GAPDH公司将每个样本的相对表达率与未处理细胞进行比较,未处理细胞的表达值指定为1。每个实验重复三次,并显示平均值和SD。数据表示为*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)<0.001,由-测试。
图9
图9
代表H3K9me2和核仁分裂之间通过rDNA区域R环积累的机制联系的模型。转录过程中形成的短暂R环被RNase H1水解,导致模板链DNA和反义链的互补。然而,在RNA聚合酶I转录抑制剂或表观遗传抑制剂BIX的存在下,H3K9me2水平显著降低,导致rDNA转录起始和R环积累增加,导致核仁结构紊乱。

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引用人

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