Coxiella effector protein CvpF subverts RAB26-dependent autophagy to promote vacuole biogenesis and virulence

doi:10.1080/15548627.2020.1728098

.2021年3月；17(3):706-722.

doi:10.1080/15548627.2020.1728098。 Epub 2020年3月1日。

科氏菌属效应蛋白CvpF破坏依赖RAB26的自噬，促进液泡的生物发生和毒力

附属公司

¹蒙彼利埃传染病研究所（IRIM）UMR 9004 CNRS，法国蒙彼利埃蒙彼利埃大学。
²德克萨斯州A&M健康科学中心医学院微生物和分子发病学系，美国德克萨斯州布莱恩。

PMID： 32116095
PMCID公司： PMC8032239号
内政部： 10.1080/15548627.2020.1728098

科氏菌属效应蛋白CvpF破坏依赖RAB26的自噬，促进液泡的生物发生和毒力

费尔南德·阿伊诺·西亚多斯（Fernande Ayenoue Siadous）等。自噬. 2021年3月.

.2021年3月；17(3):706-722.

doi:10.1080/15548627.2020.1728098。 Epub 2020年3月1日。

附属公司

¹蒙彼利埃传染病研究所（IRIM）UMR 9004 CNRS，法国蒙彼利耶蒙彼利尔大学。
²德克萨斯州A&M健康科学中心医学院微生物和分子发病学系，美国德克萨斯州布莱恩。

PMID： 32116095
PMCID公司： PMC8032239号
内政部： 10.1080/15548627.2020.1728098

摘要

贝氏柯克斯体人畜共患病Q热的病原体在宿主细胞内复制，在一个显示自身溶酶体特征的大液泡内。这个隔室的发展是由细菌效应物介导的，细菌效应物干扰许多宿主膜运输途径。通过筛选柯克西拉菌转座子突变文库，我们观察到转座子插入cbu0626导致细胞内复制和液泡生物发生缺陷。在这里，我们证明CBU0626是柯克西拉菌空泡蛋白（Cvp）是效应蛋白家族，由Dot/Icm分泌系统转运，定位于具有自溶体特征的囊泡以及柯克西拉菌-含有液泡（CCV）。因此，我们将该效应器CvpF重命名为柯克西拉菌空泡蛋白F.CvpF与宿主小GTPase RAB26特异性相互作用，导致自噬体标记物MAP1LC3B/LC3B（微管相关蛋白1轻链3β）向CCV募集。重要的是，cvpF公司：：与SCID小鼠感染模型中的野生型细菌相比，Tn突变体高度衰减，突显了CvpF对柯克西拉菌毒力。这些结果表明，CvpF控制内质体运输和宏观自噬/自噬诱导，以获得最佳效果C.伯内蒂液泡生物发生。缩写：ACCM：酸化柠檬酸半胱氨酸培养基；AP：适配器相关蛋白复合物；CCV公司：柯克西拉菌-含液泡；副总裁：柯克西拉菌空泡蛋白；GDI：鸟苷核苷酸解离抑制剂；GDF:GDI离解因子；GEF：鸟嘌呤交换因子；LAMP1：溶酶体相关膜蛋白1；MAP1LC3B/LC3B：微管相关蛋白1轻链3β；MTORC1：雷帕霉素激酶MTOR复合物1的机制靶点；PBS：磷酸盐缓冲盐水；PMA：佛波肉豆蔻酸酯醋酸酯；SQSTM1/p62：隔离体1；WT：野生型。

关键词：自噬；贝氏柯克斯体；LC3B；RAB GTPase；效应蛋白。

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数字

**图1。**
CvpF是一种Dot/Icm T4BSS空泡效应蛋白，对*柯克西拉菌*细胞内生长、CCV生物发生和毒力。（A） U2OS细胞被感染*Coxiella野生型*GFP（灰色），感染后第4天转染pLVX-mCherry-CBU0626/CvpF（红色）。我们在转染后12小时固定细胞，并用抗LAMP1抗体（绿色）标记。白色箭头表示*柯克西拉菌*CvpF和LAMP1共存的液泡。（B） U2OS细胞被激发6天*Coxiella野生型*GFP公司(*重量），cvpF*：：Tn突变或补体*cvpF公司*：：Tn应变(*cvpF公司*：：Tn Comp.）。使用Cell Profiler软件确定每个菌株的CCV面积。（C） U2OS细胞和B细胞一样被激发，基因组当量（GE）通过定量PCR（D）测定*科谢拉WT*GFP公司(*重量），cvpF*：：Tn突变或补体*cvpF公司*：：Tn应变(*cvpF公司*：：Tn Comp.）使用Cell Profiler软件确定每个菌株的菌落面积。（E） THP1细胞如D中一样受到攻击，基因组当量（GE）通过定量PCR测定。（F）*Coxiella野生型*GFP公司(*重量），dotA*：：Tn突变，*cvpF公司*：：Tn突变体和补体*cvpF公司*：：Tn应变(*cvpF公司*：：Tn Comp.）在ACCM-2中培养8d，通过Pico Green分析测定基因组当量（GE）/ml。（G）用TaqMan实时PCR计算各组5只SCID小鼠受感染脾脏在1×10激发后第14天纯化的DNA的基因组当量（GE）⁶所示应变的GE当量。（H）用1×10感染后第14天尸检时脾脏重量占总体重的百分比计算脾肿大⁶图图例中列出的应变的GE等效值。数值为3个独立实验的平均值±SD（n.s.=无显著性，***=P<0.0001，**=P<0.0021，*=P<0.033，单因素方差分析，Sidak多重比较试验）。比例尺：10μm

**图2。**
CvpF参与CCV的LC3B募集，但不参与其酸化。（A） U2OS细胞感染了*Coxiella野生型*GFP（顶部面板），*cvpF公司*：：Tn（中间面板）或补码*cvpF公司*：：Tn应变(*cvpF公司*：：Tn组件。，底板）（绿色）6天，固定并用抗LAMP1（伪彩色灰色）和LysoTracker（红色）染色。（B） U2OS细胞像A一样被感染，对CCV中存在的LysoTracker探针至少80个细胞进行评分。（C） U2OS细胞感染了*Coxiella野生型*GFP（顶部面板），*cvpF公司*：：Tn（中间面板），或补充*cvpF公司*：：Tn应变(*cvpF公司*：：Tn组件。，底部面板）固定6天，并用抗LAMP1（伪青色）和抗LC3B（红色）染色。合并图像中的白线表示用于分析强度分布的轮廓线的位置。右边显示了每个菌株的GFP（绿色）、LC3B（红色）和LAMP1（蓝色）信号的荧光强度图。（D） U2OS细胞和C细胞一样被感染，CCV上存在LC3B的细胞至少为80个。数值为3个独立实验的平均值±SD（n.s.=无显著性，***=P<0.0001，单因素方差分析，Dunnett多重比较试验）。比例尺：10μm。（E） C组图像中LC3B和LAMP1信号之间的Pearson相关系数（****=P<0.0001，单因素方差分析，Sidak多重比较检验）

**图3。**
外源表达的CvpF定位于具有自身溶酶体特征的囊泡。（A）用pLVX-mCherry-CvpF或pRK5-HA-CvpF（红色）转染U2OS或U2OS GFP-FYVE细胞。细胞被固定，并用抗LC3B或抗LAMP1抗体（绿色）标记。用抗HA抗体（红色）标记HA-CvpF。（B）用与CvpF融合的质粒pLVX-mCherry或pRK5-HA瞬时转染U2OS或U2OS-GGF-FYVE细胞_1-500、CvpF_1-370、CvpF_200至695、CvpF_370-695、CvpF_500-695，或CvpF_370-500（红色）。细胞被固定并标记有抗LC3B或抗LAMP1抗体（绿色）。用抗HA抗体（红色）标记HA标记的构建物。（C） A和B中使用的CvpF片段示意图。MBD：膜结合域，ED：效应域。比例尺：10μm

**图4。**
CvpF刺激LC3B-II的形成。（A）未感染（N.I.）或感染U2OS细胞裂解物的免疫印迹*Coxiella野生型*GFP公司(*重量），cvpF*：：Tn，10倍*cvpF公司*：：Tn(*cvpF公司*：：Tn x10）或补码*cvpF公司*：：Tn应变(*cvpF公司*：：Tn Comp.）在完全培养基中培养72小时。巴氟霉素A₁在裂解前3 h将（25 nM）添加到培养基中。用LC3B和GAPDH抗体检测免疫印迹。用巴非霉素A处理的样品显示LC3B-II与GAPDH的信号比₁（B）未感染（N.I.）或感染U2OS细胞裂解物的免疫印迹*科谢拉WT*GFP公司(*重量），cvpF*：：Tn或补码*cvpF公司*：：Tn应变(*cvpF公司*：：Tn Comp.）在完全培养基中培养72小时。细胞在裂解前在HBSS中孵育3小时可引发饥饿。用SQSTM1和GAPDH抗体检测免疫印迹。（C）转染pRK5-HA、pRK5-HA-CvpF或pRK5-HA-CvpF的U2OS细胞裂解物的免疫印迹^Y425A型模拟处理或用25 nM巴非霉素A处理₁持续1小时。用巴非霉素A处理的样品显示LC3B-II与GAPDH的信号比₁值为3个独立实验的平均值±SD（n.s.=无显著性，**=P<0.0021，*=P<0.033，单因素方差分析，Dunnett多重比较试验）

**图5。**
CvpF专门与RAB26交互。（A）使用联合转染pRK5-HA-CvpF和pLVX-GFP、pLVX-GFP-RAB5、peGFP-RAB7、peGFP-RAB9、pLVX-GFP-RAB11、pLVX-GFP-RAB26和pLVX GFP-RAB37的U2OS细胞进行联合免疫沉淀分析。分别用抗GFP和抗HA抗体检测RAB GTPases和CvpF。（B）用pLVX-mCherry或pLVX-m Cherry-CvpF（红色）和pLVX-GFP、pLVX--GFP-RAB26或pLVX-GFP-RAB37（绿色）转染U2OS细胞。（C）联合转染pRK5-HA-CvpF和pLVX-GFP、pLVX--GFP-RAB26、pLVX-GFP-RAB26的U2OS细胞的联合免疫沉淀分析^T77N型，pLVX-GFP-RAB26^问题123L，pLVX-GFP-RAB26^n177英寸分别使用抗GFP和抗HA抗体检测RAB GTPases和CvpF。（D）用pLVX-mCherry-CvpF（红色）和pLVX-GFP-RAB26瞬时转染U2OS细胞^T77N型，pLVX-GFP-RAB26^q123升或pLVX-GFP-RAB26^N177I号（绿色）。比例尺：10μm

**图6。**
CvpF刺激RAB26招募到CCV。（A） U2OS细胞感染了*Coxiella野生型*GFP公司(重量，顶部面板），*cvpF公司*：：Tn（中间面板），或补充*cvpF公司*：：Tn应变(*cvpF公司*：：Tn组件。，感染后第4天转染pLVX-GFP-RAB26（绿色）。我们在转染后12小时固定细胞，并用抗LAMP1（红色）和抗-*柯克西拉菌*（蓝色）抗体。（B） U2OS细胞被感染，如A中所示，CCV上RAB26的存在被评分为每种情况下至少80个细胞。数值为3个独立实验的平均值±SD（n.s.=无显著性，***=P<0.0001，单因素方差分析，Bonferroni多重比较试验）。比例尺：10μm。（C） A组图像中RAB26和LAMP1信号之间的Pearson相关系数（****=P<0.0001，单因素方差分析，Sidak多重比较检验）

**图7。**
RAB26活性对CCV的生物发生至关重要。（A） U2OS细胞感染*柯克西拉菌*NMII转染pLVX-GFP、pLVX--GFP-RAB26、pLVX-GFP-RAB26^t77纳米，pLVX-GFP-RAB26^问题123L或pLVX-GFP-RAB26^N177I号（绿色）感染后2天。我们在转染后24小时固定细胞，用抗LC3B（红色）染色，用Hoechst 33258（蓝色）染色DNA。白色箭头表示*柯克西拉菌*聚居地。（B）细胞按A处理，每个条件下至少测量100个细胞的CCV面积。数值为3个独立实验的平均值±SD（n.s.=无显著性，***=P<0.0001，单因素方差分析，Dunnett多重比较试验）。（C）表达非靶向导向物（导向CTRL1和导向CTRL2）或RAB26靶向导向剂（RAB26导向3、5和7）的U2OS Cas9细胞裂解物的免疫印迹。用RAB26、GAPDH和Cas9抗体进行免疫印迹检测。（D）表达非靶向导向CTRL2或RAB26靶向导向5的U2OS Cas9细胞用*Coxiella野生型*GFP公司(重量). 使用Cell Profiler软件确定每种情况的标准化CCV面积。（E） U2OS细胞如D中一样受到攻击，基因组当量（GE）通过定量PCR测定。数值为3个独立实验的平均值±SD（n.s.=无显著性，***=P<0.0001，**=P<0.00 1，非配对t检验）。比例尺：10μm

**图8。**
CvpF和RAB26的共同表达刺激LC3B阳性内体的形成。U2OS细胞转染pLVX-GFP、pLVX--GFP-RAB26、pLVX-GFP-RAB26^T77N型，pLVX-GFP-RAB26^问题123L，或pLVX-GFP-RAB26^N177I号（绿色）和pRK5-HA或pRK5-HA-CvpF。细胞固定并用抗LC3B（红色）和抗HA（蓝色）染色。比例尺：10μm

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