Caveolin-2 is regulated by BRD4 and contributes to cell growth in pancreatic cancer

doi:10.1186/s12935-020-1135-0

.2020年2月18日20时55分。

doi:10.1186/s12935-020-1135-0。电子采集2020。

Caveolin-2受BRD4调节并促进胰腺癌细胞生长

冯娇^#¹, Ting Han（音译）^#¹, 存村元^#², 梁毅毅（Yiyi Liang）¹, 崔九杰¹, 孟卓¹, 王利伟（Liwei Wang）¹

附属机构

¹1上海交通大学医学院仁济医院肿瘤科，上海市浦江路160号，200127。
²2中国上海市汾阳路83号复旦大学眼耳鼻咽喉医院病理科，201114。

^#贡献均等。

采购管理信息： 32099528
预防性维修识别码：项目管理委员会7029443
内政部： 10.1186/s12935-020-1135-0

Caveolin-2受BRD4调节并促进胰腺癌细胞生长

冯娇等。癌细胞国际. 2020.

.2020年2月18日20:55。

doi:10.1186/s12935-020-1135-0。电子采集2020。

作者

冯娇^#¹, 韩婷^#¹, 存村元^#², 梁毅毅（Yiyi Liang）¹, 崔九杰¹, 孟卓¹, 王利伟（Liwei Wang）¹

附属机构

¹1上海交通大学医学院仁济医院肿瘤科，上海市浦江路160号，200127。
²2中国上海市汾阳路83号复旦大学眼耳鼻咽喉医院病理科，201114。

^#贡献均等。

采购管理信息： 32099528
预防性维修识别码：项目管理委员会7029443
内政部： 10.1186/s12935-020-1135-0

摘要

背景：蛋白质的溴结构域和末端外结构域（BET）家族，特别是BRD4，在表观遗传学调控中发挥着重要作用，对细胞生存至关重要，也是有前途的抗癌靶点。本研究旨在分析BRD4对胰腺癌细胞生长和进展的影响及其新机制。

方法：通过免疫印迹、免疫组织化学和实时PCR分析了76例胰腺癌和配对相邻非癌组织中BRD4的表达。分析其与胰腺癌患者临床病理特征及预后的相关性。用集落形成法和硫代罗丹明B法检测BRD4对细胞增殖的影响。通过Transwell实验测定迁移和侵袭，并在裸鼠体内验证BRD4对皮下肿瘤形成的影响。流式细胞仪检测细胞周期。通过RNA测序、染色质免疫沉淀和双荧光素酶报告分析，阐明了BRD4的潜在下游靶点及其相关分子机制。

结果：BRD4在胰腺癌中过度表达。生物学结果表明，BRD4在体内外具有肿瘤促进剂的作用，促进细胞增殖、迁移和侵袭。进一步，通过RNA测序，选择caveolin-2作为BRD4的下游基因。Caveolin-2的过度表达可以部分逆转BRD4敲除引起的细胞生长能力下降，但不影响细胞迁移和侵袭。染色质免疫沉淀分析和双荧光素酶报告子分析表明，BRD4可以与小窝蛋白-2的启动子区结合，上调小窝蛋白2的表达。临床数据进一步表明BRD4和小窝蛋白-2的表达呈正相关。BRD4（高）/小窝蛋白-2（高）与胰腺癌患者较短的总体生存期相关。多元分析显示BRD4和caveolin-2均为独立因素。

结论：我们的研究结果揭示了BRD4在胰腺癌中的致癌作用，并阐明了BRD4-和小窝蛋白-2促进细胞生长的可能机制。通过开发BET抑制剂靶向BRD4-卡韦林-2相互作用将是胰腺癌的一种治疗策略。

关键词：BET抑制剂；BRD4；洞穴蛋白-2；胰腺癌。

©作者2020。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性利益作者声明他们没有竞争性利益。

数字

图1
BRD4在PC中过度表达。一与邻近正常组织相比，10个新鲜PC样本中BRD4 mRNA表达较高。检测GAPDH表达作为内源性对照。b条BRD4表达的代表性免疫组织化学图像，主要定位于细胞核。前列腺癌组织中BRD4蛋白表达较高。**c（c）**7株PC细胞中有5株，包括AsPC-1、MIAPaCa-2、PANC-1、SW1990和CFPAC-1，BRD4 mRNA水平高于正常胰腺导管上皮细胞HPDE。GAPDH表达被检测为mRNA表达的内源性控制。d日PC细胞系中BRD4和CAV-2蛋白表达较高。BRD4与CAV-2表达呈正相关。星号表示p小于0.05

图2
BRD4在体外促进PC细胞增殖、迁移和侵袭。一Western blot用于确认BRD4敲除对CFPAC-1和PANC-1细胞系的疗效。转染24小时后测定转染效率。结果表明，BRD4敲除导致G1细胞周期CDK4和CDK6减少，而p21增加。b条硫酸罗丹明B试验表明，与BRD4-nc组相比，BRD4-si1和BRD4-si组均显著抑制细胞增殖。**c（c）**平板克隆形成显示，与BRD4-nc组相比，BRD4-si1和BRD4-si组均显著抑制克隆形成。d日迁移实验表明，与BRD4-nc组相比，BRD4-si1和BRD4-si组均显著抑制细胞迁移和侵袭。**e（电子）**Western blot用于确认su.86.86中BRD4过度表达的疗效。**（f）**硫酸罗丹明B检测显示，与BRD4-ctrl组相比，BRD4-over组显著促进细胞增殖。克迁移实验表明，与BRD4-ctrl组相比，BRD4-over组显著增加了细胞迁移和侵袭。星号表示p小于0.05

图3
BRD4增加体内PC细胞的生长。一–**c（c）**皮下肿瘤移植试验表明，与PANC-1/BRD4-nc组相比，PANC-1/BRD4-sh1组和PANC-1/FRD4-sh2组的生长速度较慢(一)和肿瘤重量(b条,**c（c）**).d日BRD4、ki67和裂解Caspase3表达的代表性免疫组织化学图像。与PANC-1/BRD4-nc相比，PANC-1/BRD4-sh1和PANC-1/FRD4-sh2组的BRD4和ki67表达较低。然而，在所有组中，裂解的Caspase 3均呈阴性表达。比例尺，50μm。星号表示p小于0.05

图4
CAV-2是BRD4的下游目标。一利用RNA序列鉴定BRD4的下游靶点。结果表明，共有27个差异表达基因，12个上调，15个下调。其中，CAV-2的下调幅度居第二位。b条,**c（c）**CAV-2 mRNA(b条)和蛋白质(**c（c）**)BRD4-si1和BRD4-si组的水平均下调。d日,**e（电子）**与BRD4-ctrl组相比，CAV-2 mRNA(d日)和蛋白质(**e（电子）**)BRD4-over组表达上调。**（f）**硫酸罗丹明B试验表明，与CAV-2-nc组相比，CAV-2-si1和CAV-2-si2组均显著抑制细胞增殖。克硫酸罗丹明B试验表明，与BRD4-ctrl组相比，CAV-2过度组显著促进细胞增殖。小时迁移实验表明，与CAV-2-nc组相比，CAV-2-si1和CAV-2-si2组均未显著抑制细胞迁移和侵袭。我迁移实验表明，与BRD4-ctrl组相比，BRD4-over组没有显著增加细胞迁移和侵袭。星号表示p小于0.05

图5
CAV-2过度表达部分恢复BRD4-siRNA介导的细胞增殖。一Western blot检测BRD4 nc/siRNA和CAV-2 ctrl/over质粒共转染CFPAC-1和PANC-1细胞时BRD4、CAV-2、PCNA、C-myc、CDK2和pRb的表达。BRD4降低PCNA、C-myc、CDK2和pRb的表达。CAV-2过度表达可部分逆转BRD4抑制的蛋白表达。b条,c。硫酸罗丹明B分析(b条)和板块克隆构造(**c（c）**)表明CAV-2的过度表达部分逆转了BRD4敲除后细胞增殖的下降。d日细胞周期实验表明，抑制BRD4可诱导G1期阻滞。CAV-2过度表达可以部分逆转BRD4基因敲除的影响。星号表示p小于0.05

图6
BRD4调节CAV-2转录活性。一ChIP结果表明，BRD4可以直接与启动子区结合（0~−500 bp，− 500~−1000 bp和− 1000~−1500 bp）。b条与BRD4-nc组相比，BRD4-si1对CAV-2启动子的BRD4募集减少。**c（c）**荧光素酶报告实验表明BRD4在 1500 ~ CAV-2的0 bp启动子区。在干扰BRD4表达后，CAV-2的转录激活可能受到抑制。星号表示p小于0.05

图7
前列腺癌患者BRD4和CAV-2表达与预后的关系。一log-rank检验表明，表达高BRD4水平的PC肿瘤患者的OS显著低于表达低BRD4的患者。b条CAV-2高表达患者的OS显著低于CAV-2低表达患者。**c（c）**log-rank检验表明，与其他组相比，PC患者的BRD4（高）/CAV-2（高）与较短的OS相关，包括BRD4/CAV-2（低）、BRD4/CA V-2（高）和BRD4/CAV-2。d日连续组织学切片显示BRD4和CAV-2表达呈正相关

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