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.2021年2月;17(2):553-577.
doi:10.1080/15548627.2020.1725401。 Epub 2020年2月25日。

HIV-1 Nef通过增强BECN1及其抑制剂BCL2之间的关联以PRKN依赖的方式对抗自噬限制

附属公司

HIV-1 Nef通过增强BECN1及其抑制剂BCL2之间的关联以PRKN依赖的方式对抗自噬限制

塞尔吉奥·卡斯特罗·冈萨雷斯等。 自噬. 2021年2月.

摘要

大自噬/自噬是一种自身消化促生存途径,在对溶酶体降解靶向货物的应激反应中被激活。近年来,自噬作为一种固有的抗病毒防御机制,通过多种过程,如靶向病毒和病毒成分以消除病毒,已成为一种突出的机制。这些令人兴奋的发现鼓励了对自噬能力限制HIV的研究。然而,自噬在HIV感染中的作用尚不清楚。尽管一些报告表明自噬对HIV有害,但另一些报告声称HIV故意激活这一途径以增加其传染性。此外,这些对比结果似乎取决于所调查的细胞类型。在这里,我们表明自噬对HIV复制构成了障碍,显著减少了病毒粒子的产生。然而,HIV-1使用其辅助蛋白Nef来抵消这种限制。先前的研究表明,Nef通过阻止自噬体和溶酶体之间的融合来影响自噬成熟。在这里,我们发现Nef通过增强BECN1及其抑制剂BCL2之间的联系来阻断自噬的启动,这种活性依赖于细胞E3连接酶PRKN。值得注意的是,Nef对抗自噬阻断的能力在大流行性HIV-1及其猴前体SIV中更为常见cpz公司感染黑猩猩比感染HIV-2及其前体SIVsmm公司感染了煤烟的白眉猴。总之,我们的发现表明HIV-1易受自噬限制,并将Nef定义为该抗病毒过程的主要自噬拮抗剂。缩写:3-MA:3-甲基腺嘌呤;ACTB:肌动蛋白,β;ATG16L1:自噬相关16样1;BCL2:BCL2凋亡调节因子;BECN1:贝克林1;cDNA:互补DNA;EGFP:增强型绿色荧光蛋白;ER:内质网;Gag/p55:群体特异性抗原;GFP:绿色荧光蛋白;GST:谷胱甘肽S转移酶;HA:血凝素;HIV:人类免疫缺陷病毒;IP:免疫沉淀;MAP1LC3B/LC3B:微管相关蛋白1轻链3β;Nef:负因子;PRKN:parkin RBR E3泛素连接酶;PtdIns3K:磷脂酰肌醇3激酶;PtdIns3P:磷脂酰肌醇3磷酸盐;PTM:翻译后修饰;RT-qPCR:逆转录后定量PCR;RUBCN:红细胞自噬调节因子;SEM:平均值的标准误差;SERINC3:丝氨酸合并剂3;SERINC5:丝氨酸合并剂5;SIV:猴免疫缺陷病毒;SQSTM1/p62:隔离体1;TFEB:转录因子EB;UVRAG:抗紫外线相关基因;VSV:水疱性口炎病毒;ZFYVE1/DFCP1:锌指FYVE型,含1。

关键词:自噬;BCL2;BECN1;间隙;艾滋病病毒;Nef;PRKN公司。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人没有报告潜在的利益冲突。

数字

图1。
图1。
HIV使用Nef阻断自噬。(A) 左图:HEK293T细胞转染HIV-1 NL4-3全长前病毒DNA,该分子克隆的不同突变体(Δ虚拟专用单元, Δ环境价值,Δnef(奈夫)和Δ虚拟专用数据库)或空的逆转录病毒载体。作为自噬的对照,用4μM雷帕霉素或模拟物(DMSO)处理细胞4小时。转染48 h后,通过western blot分析细胞的SQSTM1、Gag(p55和p24)、LC3和ACTB/β-actin。右侧面板:进行密度分析,以确定LC3-II与LC3-I相对于空载体对照的比率。数据表示来自4个独立生物重复的平均值(SEM)的平均值和标准误差。(B) 尤尔卡特CD4+T细胞、(C)THP-1衍生巨噬细胞和(D)初级CD4+用100 ng与HIV-1 NL4-3或HIV-1 HL4-3Δ相等的p24感染T细胞nef(奈夫)巨噬细胞感染VSV-G假型HIV-1 NL4-3Δ环境价值或HIV-1 NL4-3Δ环境价值Δnef(奈夫)在指定的时间间隔收集细胞裂解物,并通过western blot分析SQSTM1、Gag(p55和p24)、Nef、LC3和ACTB(左侧面板)。右侧面板对应于三个独立实验的平均值和SEM,显示LC3-II:I随时间相对于第一个数据点的比率,该比率通过密度分析计算得出。*:第页≤ 0.05; **:第页≤ 0.01. 面板A中的红色箭头表示Gag和SQSTM1水平下降,以及LC3-I到LC3-II的快速转变。面板C和D中的红色箭头表示LC3-I的累积
图2。
图2。
自噬限制了病毒粒子的产生nef(奈夫)-有缺陷的HIV。(A) 顶部面板:HEK293T细胞转染HIV-1 NL4-3或NL4-3Δ全长前病毒DNAnef(奈夫)并用指定浓度的雷帕霉素处理12小时。然后,通过培养上清液中与每种病毒的非拉帕霉素治疗相关的HIV p24的积累来测量最大病毒生成的百分比。底部面板:细胞还通过western blot分析Gag p55、Nef、ACTB和LC3。(B) 顶部面板:HEK293T细胞转染HIV-1 NL4-3Δ前病毒DNAnef(奈夫)并使用NL4-3或NL4-3进行转换nef(奈夫)或空向量。与A组相似,细胞被增加浓度的雷帕霉素处理12小时,与no-rapamycin处理相比,最大病毒产生量的百分比如上文所述。底部面板:如面板A所示分析细胞裂解物。(C)顶部面板:HEK293T细胞转染HIV-1 NL4-3Δ的前病毒DNAnef(奈夫)增加雷帕霉素浓度刺激12h。接下来,在测量颗粒释放百分比之前,用3-MA(3 mM)或水处理细胞4小时。底部面板:与面板A一样,细胞也通过western blot进行分析。(D)左侧面板:HEK293T细胞转染siRNABECN1公司24小时后,再次将HIV-1 NL4-3Δ的前病毒DNA转染细胞nef(奈夫)并用雷帕霉素处理12小时。接下来,如上所示测量最大病毒生成的百分比。右侧面板:还分析了BECN1、Gag p55、Nef、ACTB和LC3的细胞裂解物。(E) 左侧面板:Jurkat CD4+T细胞感染100 ng等同于HIV-1 NL4-3或HIV-1 HL4-3Δ的p24nef(奈夫)24h后,更换细胞培养基并补充不同浓度的雷帕霉素。12小时后,如上所述测量最大病毒生成百分比。右侧面板:如面板A所示,对细胞裂解物进行分析。在每种情况下,最大病毒生成百分比表示为4个独立生物复制品的平均值和SEM。*:第页≤ 0.05; **第页≤ 0.01; ****第页≤ 0.0001. 印迹下面的数字表明LC3-II:I相对于no-rapamycin治疗的比率
图3。
图3。
Nef损害LC3的脂质化,影响自噬体的形成。(A,B)HEK293T细胞转染NL4-3nef(奈夫)或空向量。48小时后,细胞(A)暴露于指定浓度的雷帕霉素,或(B)饥饿选定时间。左图:通过蛋白质印迹分析细胞的SQSTM1、Nef、LC3和ACTB。右侧面板:数据表示3个独立的生物复制品的LC3-II与LC3-I之比的平均值和SEM,与空载体对照(分别为不含雷帕霉素或饥饿后1天)相比。(C) 用NL4-3转染HEK293T细胞nef(奈夫)或空向量。接下来LC3B公司ATG16L1型在选定的时间点通过RT-qPCR进行评估,并在标准化至GAPDH公司GFP公司数据表示来自3个独立生物复制的平均值和SEM。虚线表示生物相关差异的截止线。(D) HEK293T细胞用HIV-1 NL4-3或NL4-3Δnef(奈夫)前驱结构。用雷帕霉素处理或转染空逆转录病毒载体的细胞作为对照。24小时后,用二甲基亚砜或氯喹(60μM)处理细胞12小时。接下来,通过western blot分析细胞的Gag(p55和p24)、SQSTM1、LC3和ACTB。与病媒控制相关的SQSTM1:ACTB和LC3-II:I比率在斑点下方提供。(E) HEK293T细胞与EGFP共转染-LC3B公司和空向量或NL4-3nef(奈夫)-HA。作为对照,细胞也用雷帕霉素(4μM)和3-MA(3 mM)处理。转染后48小时,通过流式细胞术分析细胞的自噬体相关EGFP-LC3B。数据对应EGFP百分比的平均值和SEM+来自3个独立实验的细胞。(F,G)HEK293T细胞与EGFP共转染-LC3B公司或者是一个空向量,消费税-HA(F)或NL4-3nef(奈夫)-HA(G)。在显微镜下观察之前,细胞在有无3-MA(3 mM)的情况下暴露于雷帕霉素(4μM)中4小时。接下来,对细胞进行GFP(绿色)、HA(DyLight-550;红色)和细胞核(DAPI;蓝色)染色。(H) 数据对应于每种实验条件下随机选择的20个细胞中EGFP-LC3B点的平均值和SEM。*:第页≤ 0.05; **:第页≤ 0.01; ***:第页≤ 0.001; ****:第页≤ 0.0001; n.s.不重要。红色箭头:LC3-I累积。白色比例尺:10μm。被白色边框包围的细胞为HA+
图4。
图4。
Nef增强BECN1和BCL2之间的联系,阻止自噬启动。(A) 用NL4-3转染HEK293T细胞nef(奈夫)或空向量。48 h后,细胞暴露于雷帕霉素(4μM)4 h。通过western blot分析细胞裂解产物,以评估蛋白ULK1、ATG12–ATG5、ATG7、ATG3、BECN1、ATG16L1、BCL2、Nef和ACTB的表达水平。(B) BCL2对BECN1依赖性自噬启动的调节作用示意图。(C) 用NL4-3转染HEK293T细胞nef(奈夫)或空向量。48小时后,从细胞裂解物中免疫沉淀BCL2,以评估其泛素化和SUMO化水平。还通过蛋白质印迹分析细胞裂解物以评估Nef、p-BCL2、BCL2和ACTB的水平。(D) HEK293T细胞与BECN1公司-旗帜和NL4-3nef(奈夫)或空向量。48小时后,对细胞裂解物进行BECN1免疫沉淀。然后检查下拉部分是否存在BECN1和BCL2。用western blot分析细胞裂解物,以评估BECN1、Nef、BCL2和ACTB的细胞水平。图:数据表示6个独立生物复制的平均值和SEM,以计算通过密度分析获得的BECN1和BCL2之间的相对结合。(E) 左图:HEK293T细胞转染HIV-1前病毒全长DNA NL4-3或NL4-3Δnef(奈夫).24小时后,更换细胞培养基,用指示浓度的雷帕霉素和二甲基亚砜或雷帕霉素与GX15-070的混合物处理细胞12小时50(3μM),BCL2抑制剂。然后,通过培养上清液中HIV p24的积累,测量每种病毒和条件下相对于no-rapamycin治疗的最大病毒生成百分比。数据表示3个独立生物重复的平均值和SEM。右图:转染HIV-1 NL4-3前病毒结构的样本的细胞裂解液也分析Gag p55、Nef、ACTB和LC3。五: 向量。相对:相对。Ab-ctr:细胞裂解物与用于下拉分析的抗体孵育,以从目标蛋白中排除与抗体的重链和轻链(HC和LC)相对应的条带。星号:BCL2的差异迁移模式。磅征:泛素化BCL2.*:第页≤ 0.05; ***第页≤ 0.001; n.s.不重要
图5。
图5。
Nef增强的BECN1和BCL2之间的关联依赖于PRKN。(A) HEK293T和HeLa细胞被联合转染BECN1公司-标志和NL4-3nef(奈夫)或空向量。此外,HeLa细胞被转补体PRKN公司-MYC公司。转染后48小时,对细胞裂解物进行内源性BCL2的免疫沉淀,并检查下拉部分是否存在BECN1和BCL2。细胞裂解物也进行western blot以评估蛋白PRKN、BECN1、ACTB、Nef、BCL2和LC3的细胞水平。在斑点下方提供了LC3-II与LC3-I相对于空载体的比率。图:密度分析用于确定BECN1和BCL2之间相互作用的相对水平。数据表示4个独立生物复制的平均值和SEM。(B) 用shRNA去除HEK293T细胞中的PRKN,然后用BECN1公司-旗帜和NL4-3nef(奈夫)或空向量。接下来,通过免疫沉淀和western blot分析细胞裂解物的BECN1-BCL2相互作用。与面板A类似,根据ACTB标准化的相对PRKN表达水平以及LC3-II与LC3-I的比率在印迹下方提供。图表:密度分析用于确定BECN1和BCL2之间相互作用的相对水平。数据表示4个独立生物复制的平均值和SEM。(C) 左图:HEK293T细胞被shRNA耗尽PRKN,然后转染HIV-1 NL4-3全长前病毒DNA。用指定浓度(0-4μM)的雷帕霉素处理细胞12小时。然后通过培养上清液中HIV p24的积累来测量与非拉帕霉素治疗相关的最大病毒生成百分比。数据表示3个独立生物复制的平均值和SEM。右图:还分析了细胞裂解液中的Gag p55、PRKN、ACTB和LC3。下面提供了LC3-II与LC3-I相对于相应的no-rapamycin治疗的比率。(D) HEK293T细胞与NL4-3共转染nef(奈夫)-HA和PRKN公司-MYC或空向量。包括人CD4作为Nef结合的阳性对照。48h后,细胞裂解并免疫沉淀HA。检测亲和分离部分是否存在PRKN-MYC、CD4和Nef-HA。还分析了细胞裂解物中PRKN-MYC、CD4、ACTB和Nef-HA的表达。五: 向量。相对:相对。抗体控制:抗体控制。LC:轻链。*:第页≤ 0.05; **第页≤ 0.01; ***第页≤ 0.001; n.s.不重要
图6。
图6。
Nef促进BECN1-BCL2在ER中的结合。(A)HEK293T细胞与BECN1公司-标记和总GFP-BCL2级(总BCL2),ER-GFP-BCL2级(内质网相关BCL2)或Mit-GFP-BCL2级(线粒体BCL2)。此外,用NL4-3转染细胞nef(奈夫)或空向量。48小时后,对细胞裂解物进行BCL2免疫沉淀。检查下拉部分是否存在BECN1、GFP-BCL2和Ub-BCL2。用western blot分析细胞裂解物,以评估BECN1、p-BCL2、ACTB、GFP-BCL2,Nef和LC3的细胞水平。图:密度分析用于确定BECN1和BCL2之间的相对相互作用以及泛素化BCL2的相对水平。数据表示5个独立生物复制的平均值和SEM。(B) HEK293T细胞与BECN1公司-ER-GFP旗-BCL2级或者消费税-HA或NL4-3nef(奈夫)-HA。48小时后,对细胞进行HA(DyLight-550;红色)、ER-GFP-BCL2(绿色)、BECN1-Flag(Alexa Fluor 633;洋红)和细胞核(DAPI;蓝色)染色。提供HA、ER-GFP-BCL2和BECN1-Flag的合并。BECN1和BCL2共定域的皮尔逊相关系数在每个实验条件下的15个独立事件的图表中提供。(C) Nef阻止自噬启动的拟议机制。相对:相对。抗体控制:抗体控制。*:第页≤ 0.05; **:第页≤ 0.01; ***:第页≤0.001。白色刻度条:10μm
图7。
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Nef增强的BCL2对BECN1的隔离也影响自噬成熟。(A) HEK293T细胞与BECN1公司-标志和空向量,NL4-3nef(奈夫)和/或ER-GFP-BCL2级.48 h后,对细胞进行UVRAG免疫沉淀,并对下拉部分进行UVRAG和BECN1-Flag的分析。还对细胞裂解物进行了UVRAG、BECN1、ACTB、ER-GFP-BCL2、Nef和LC3检测。图:密度分析用于确定BECN1和UVRAG之间的相对相互作用。数据表示3个独立生物复制品的平均值和SEM。(B-D)NefA36-A39飞机通过流式细胞术检测其通过自噬体相关EGFP-LC3B(B)的积累阻断自噬小体形成的能力,通过western blot(C)检测其阻止LC3脂质化的能力,以及通过联合免疫沉淀(D)增强BECN1-BCL2相互作用的能力。如前所述,在HEK293T细胞中进行了检测。pCGCG-EGFP或pcDNA5被用作载体对照,NL4-3nef(奈夫)或NL4-3nef(奈夫)-HA用于表达HIV-1 Nef。数据对应于4个独立实验的平均值和SEM。相对:相对。抗体控制:抗体控制。LC:轻链。*:第页≤ 0.05; **:第页≤ 0.01
图8。
图8。
Nef抑制自噬的能力主要见于HIV-1/SIVcpz公司(A)慢病毒Nef蛋白抗自噬特性分析的代表性数据。用NL4-3转染HEK293T细胞nef(奈夫)、空向量和SIV雨衣239nef(奈夫)48小时后,将细胞暴露于浓度增加的雷帕霉素(0-4μM)中4小时。接下来,通过western blot分析细胞的SQSTM1、Nef、LC3和ACTB水平。进行密度分析,以确定SQSTM1:ACTB的水平以及LC3-II与LC3-I的比值,该比值相对于未经雷帕霉素处理的空载体对照。(B,C)数据对应于不同慢病毒的3个独立生物复制品的相对LC3-II:I比率的平均值和SEMnef(奈夫)HIV-1/SIV的等位基因cpz公司血统(B)和HIV-2/SIVsmm公司血统(C)。(D) 比较不同慢病毒物种Nef的氨基酸序列,并将其聚集在枝序图中,其中显示了每个变体之间的相对进化距离。色码方块用于识别Nef能够抑制自噬(实线)或显示部分活性(虚线)的物种。*:第页≤ 0.05; **:第页≤ 0.01; n.s.不重要。红色箭头表示Nef等位基因对自噬具有活性

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引用人

工具书类

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出版物类型

赠款和资金

这项工作得到了德克萨斯理工大学[创业基金]的支持。Frank Kirchhoff博士得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft的支持[CRC 1279和SPP 1923]。Konstantin Sparrer博士得到了欧洲研究委员会(European Research Council)和德国Forschungsgemeinschaft(SP1600/4-1和SPP1923])的Marie-Sklodowska-Curie奖学金(“VIAR”)的支持。Marta Colomer-Luch博士得到了Recerca i Societat de la Informació大学系的支持[Beatriu de Pinós 2017BP00075]。