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.2020年1月24:2020:4508108。
doi:10.1155/2020/4508108。 eCollection 2020。

miR-142-5p作为CXCR4靶向MicroRNA通过失活MAPK信号通路抑制SDF-1诱导的软骨细胞凋亡和软骨降解

Yaoyv Xiang先生 1, 李彦林 1, 杨凌剑 1, 何英红 1, 狄佳 1, 西单湖 2
附属公司

miR-142-5p作为CXCR4靶向MicroRNA通过失活MAPK信号通路抑制SDF-1诱导的软骨细胞凋亡和软骨降解

Yaoyv Xiang先生等。 生物化学研究国际. .

摘要

骨关节炎（OA）是一种以软骨细胞减少和细胞外基质（ECM）成分破坏为特征的慢性关节功能紊乱。MicroRNAs（miRNAs）和SDF-1/CXCR4轴是软骨细胞凋亡和ECM变性的重要因素。然而，迄今为止，很少有研究调查骨关节炎中miRNAs与SDF-1/CXCR4轴之间的相关性。在这里，通过miRNAs微阵列和生物信息学分析，我们确定miR-142-5p是OA患者软骨以及SDF-1诱导的OA软骨细胞中CXCR4靶向且显著下调的miRNA在体外在转染miR-142-5p模拟物或抑制剂的SDF-1处理的原代人OA软骨细胞中，发现CXCR4的表达与miR-142.5p的表达呈负相关。双荧光素酶报告物分析进一步验证了miR-142-5p和CXCR4之间的靶向关系。miR-142-5p的过度表达通过抑制软骨细胞凋亡减轻了OA病理，即使在CXCR4过度表达的OA软骨细胞中也是如此。这与软骨基质降解减少、软骨炎症减少和MAPK信号通路失活有关。我们的研究表明，上调CXCR4靶向miR-142-5p的表达可以抑制OA软骨细胞的凋亡、炎症和基质分解代谢，并使MAPK信号通路失活。我们的工作为OA治疗中靶向miR-142-5p和SDF-1/CXCR4轴提供了重要见解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，本论文的出版不存在利益冲突。

数字

图1
图1
通过miRNA微阵列和生物信息学分析筛选和鉴定参与骨关节炎发病机制中SDF-1/CXCR4轴的候选miRNA（a，b）。通过对OA患者和健康软骨组织样本的miRNA微阵列分析，筛选出异常表达的miRNA。显示了OA软骨组织中最高下调的miRNA（a）和上调的miRNA（b）。（c） 免疫组织化学染色显示CXCR4在SDF-1诱导的人软骨细胞中的表达。比例尺，50 μm.（d）（c）中所示软骨细胞中CXCR4相对表达的量化。（e） 在对照组和SDF-1刺激的OA人软骨细胞中，四种下调最明显且推测为CXCR4靶向miRNAs的水平（100 纳克/毫升，24小时 h） 通过qRT-PCR测定。n个 = 每组8个。重大差异如下所示∗第页<0.05和∗∗第页<0.01。miRNAs，microRNAs；SDF-1，基质细胞衍生因子1。
图2
图2
CXCR4是miR-142-5p的直接靶点，并受miR-142-5 p的负调控。（a） 显示miR-142-5p与CXCR4预测的3′UTR位点结合的设计方案。在携带突变3′UTR的报告载体中，miR-142-5p的结合位点AGUGC被突变为UGAGC。将野生型（WT）或突变型（Mut）CXCR4 3′UTR与miR-142-5p模拟物或阴性对照模拟物共转染后48小时，在293T细胞中检测到报告载体的荧光素酶活性。N个 = 每组3个。（b-e）用阴性对照（NC）模拟物、miR-142-5p模拟物、NC抑制剂和miR-1425p抑制剂转染原代人OA软骨细胞，并用SDF-1（100 纳克/毫升） h.然后通过qRT-PCR测定miR-142-5p（b）和CXCR4（c）的表达水平。Western blot检测CXCR4蛋白水平。代表性波段图像如（d）所示，相对波段强度如（e）所示。N个 = 每组3个。数据表示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 3).∗第页< 0.05;∗∗第页< 0.01与数控模拟；#第页<0.05和##第页< 0.01与NC抑制剂。miRNAs，microRNAs；SDF-1，基质细胞衍生因子1；NC，阴性对照；Gapdh，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
图3
图3
miR-142-5p过表达通过靶向CXCR4减弱SDF-1诱导的软骨细胞凋亡。（a–e）用指示的miRNA模拟物和质粒转染原代人OA软骨细胞。48岁时 转染后h，用SDF-1（100）处理细胞 ng/ml）另加24 用流式细胞术检测软骨细胞凋亡。Annexin-V和PI染色的代表性流型如图（a）所示，并总结了原代人OA软骨细胞的凋亡率（b）。（c） 用RT-qPCR检测Bax和Bcl-2的mRNA水平。（d-e）通过蛋白质印迹分析测定裂解的胱天蛋白酶-3、裂解的PARP、Bax和Bcl-2的表达水平。代表性波段图像如（d）所示，相对波段强度如（e）所示。数据表示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 3).∗第页< 0.05;∗∗第页< 0.01与miR-NC + 矢量群；#第页<0.05和##第页< 0.01与miR-142-5p模拟物 + 向量组。miRNAs，microRNAs；SDF-1，基质细胞衍生因子1；NC，阴性对照；Bcl-2、B细胞淋巴瘤-2；裂解的PARP，裂解的聚ADP核糖聚合酶；Gapdh，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
图4
图4
miR-142-5p可对抗SDF-1诱导的软骨细胞中的炎症和基质降解。（a–k）用指示的miRNA模拟物和质粒转染原代人OA软骨细胞。48岁时 转染后h，用SDF-1（100）处理细胞 ng/ml）另加24 h.（a）IL-1的释放β、（b）IL-10和（c）TNF-α用ELISA试剂盒检测培养上清液。（d） qRT-PCR检测MMP-13 mRNA表达水平。（e，f）通过Western blot检测MMP-13表达的蛋白水平。代表性波段图像如（e）所示，相对波段强度如（f）所示。（g-h）指示转染后原代人OA软骨细胞中II型胶原（g）和聚集蛋白聚糖（h）表达的免疫荧光分析。比例尺，50 μm.（i–k）用Western blot分析测定II型胶原（j）和聚集蛋白聚糖（k）的蛋白质表达，并显示代表性的条带图像（i）。∗第页< 0.05;∗∗第页< 0.01与miR-NC + 矢量群；#第页<0.05和##第页< 0.01与miR-142-5p模拟物 + 向量组。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 3). miRNAs，microRNAs；SDF-1，基质细胞衍生因子1；NC，阴性对照；白介素-1β，白介素-1β; IL-10、IL-10；TNF公司-α，肿瘤坏死因子α; 基质金属蛋白酶-13；ACAN，聚集蛋白聚糖；Ⅱ型胶原；Gapdh，甘油醛‐3‐磷酸脱氢酶；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。
图5
图5
miR-142-5p调节SDF-1诱导的软骨细胞中的MAPK信号通路。（a–e）用指示的miRNA模拟物和质粒转染原代人OA软骨细胞。48岁时 转染后h，用SDF-1（100）处理细胞 ng/ml）再给24 h.然后通过Western blot分析测定MAPK（JNK、p38、ERK、p-JNK，p-p38和p-ERK）信号通路中关键分子的蛋白表达。图中显示了MAPK（a）信号通路中分子的代表性谱带图像。CXCR4（b）的相对谱带强度和p-p38的比值/第页总结了38（c）、p-ERK/ERK（d）和p-JNK/JNK（e）。数据表示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 3).∗第页< 0.05;∗∗第页< 0.01. miRNAs，microRNAs；SDF-1，基质细胞衍生因子1；NC，阴性对照；ERK，细胞外调节蛋白激酶；p-ERK，磷酸化细胞外调节蛋白激酶；JNK，c-Jun N末端激酶；p-JNK，磷酸化c-Jun N末端激酶；Gapdh，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
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