MiR-612 regulates invadopodia of hepatocellular carcinoma by HADHA-mediated lipid reprogramming

doi:10.1186/s13045-019-0841-3

.2020年2月7日；13(1):12.

doi:10.1186/s13045-019-0841-3。

MiR-612通过HADHA介导的脂质重编程调控肝癌侵袭性

杨柳^1 2, 李丽露¹, 多文^1 三, 刘东丽^1 4, 李丽东¹, 董美高¹, 新余边¹, Jian Zhou公司^1 5, 贾凡^6 7, 吴伟忠⁸

附属公司

¹复旦大学中山医院肝癌研究所，肿瘤发生与肿瘤侵袭教育部重点实验室，上海市枫林路180号，邮编200032。
²上海交通大学医学院上海第九人民医院口腔颌面部头颈肿瘤科，中国上海。
^三复旦大学上海肿瘤中心头颈外科，上海，200032，中国。
⁴上海交通大学上海总医院放射肿瘤科，上海，200080。
⁵复旦大学中山医院肝外科与移植科，上海，200032，中国。
⁶复旦大学中山医院肝癌研究所，肿瘤发生与肿瘤侵袭教育部重点实验室，上海市枫林路180号，邮编200032。fan.ja@zs-hospital.sh.cn。
⁷复旦大学中山医院肝外科与移植科，上海，200032，中国。fan.ja@zs-hospital.sh.cn。
⁸复旦大学中山医院肝癌研究所，肿瘤发生与肿瘤侵袭教育部重点实验室，上海市枫林路180号，邮编200032。wu.weizhong@zs-hospital.sh.cn。

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MiR-612通过HADHA介导的脂质重编程调控肝癌侵袭性

杨柳等。血液肿瘤杂志. 2020.

.2020年2月7日；13(1):12.

doi:10.1186/s13045-019-0841-3。

作者

杨柳^1 2, 李丽露¹, 多文^1 三, 刘东丽^1 4, 李丽东¹, 董美高¹, 《新语编》¹, Jian Zhou公司^1 5, 贾凡^6 7, 吴伟忠⁸

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¹复旦大学中山医院肝癌研究所，肿瘤发生与肿瘤侵袭教育部重点实验室，上海市枫林路180号，邮编200032。
²上海交通大学医学院上海第九人民医院口腔颌面部头颈肿瘤科，中国上海。
^三复旦大学上海肿瘤中心头颈外科，上海，200032，中国。
⁴上海交通大学上海总医院放射肿瘤科，上海，200080。
⁵复旦大学中山医院肝外科与移植科，上海，200032，中国。
⁶复旦大学中山医院肝癌研究所，肿瘤发生与肿瘤侵袭教育部重点实验室，上海市枫林路180号，邮编200032。fan.jia@zs-hospital.sh.cn。
⁷复旦大学中山医院肝外科与移植科，上海，200032，中国。fan.ja@zs-hospital.sh.cn。
⁸复旦大学中山医院肝癌研究所，肿瘤发生与肿瘤侵袭教育部重点实验室，上海市枫林路180号，邮编200032。wu.weizhong@zs-hospital.sh.cn。

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更正：MiR-612通过HADHA介导的脂质重编程调节肝癌的侵袭性。
刘毅、卢磊、文德、刘DL、董磊、高德明、卞XY、周杰、范杰、吴伟忠。刘毅等。血液肿瘤学杂志。2020年5月4日；13(1):44. doi:10.1186/s13045-020-00875-5。血液肿瘤杂志。2020 采购管理信息：32366313 免费PMC文章。

摘要

背景：MicroRNA-612（miR-612）已被证明通过PI3K/AKT2和Sp1/Nanog信号抑制肝细胞癌（HCC）的EMT、干细胞和肿瘤转移。然而，其在肝癌进展中的生物学作用还远未阐明。

方法：我们通过RNA免疫沉淀和测序发现miR-612的直接下游靶点hadha。为了探讨其生物学特性、潜在分子机制以及在肝癌患者中的临床相关性，我们进行了几种体外和体内模型以及人体组织芯片的研究。

结果：miR-612的异位表达可部分逆转HADHA水平，进而抑制伪足功能，并通过脂质重编程降低肝癌的转移和侵袭潜能。具体而言，miR-612可能通过HADHA介导的细胞膜胆固醇改变来减少侵入体的形成，并伴有Wnt/β-catenin调控的EMT发生的抑制。我们的结果表明，HCCLM3的最大耗氧率（OCR）^{miR-612-OE型}和HCCLM3^哈达-KD细胞数量分别减少了40%和60%（p<0.05）。在外源性miR-612或hadha-shRNA转染的HCCLM3细胞系中，乙酰辅酶A水平显著降低，约为对照组的1/3（p>0.05）或1/2（p<0.05）。此外，hadha细胞系的过度表达使总胆固醇，尤其是27-羟基胆固醇的表达水平较高（p<0.005）。SREBP2蛋白表达水平及其下游靶点HMGCS1、HMGCR、MVD、SQLE均被HADHA解除调控。同时，HCCLM3的ATP水平降低至1/2和1/4^{miR-612-OE型}（p<0.05）和HCCLM3^哈达-KD（p<0.01）。此外，miR-612水平低而HADHA水平高的患者预后较差，总体生存期较短。

结论：miR-612可以通过HADHA介导的脂质编程抑制侵袭因子、EMT和HCC转移的形成，这可能为miR-611在肿瘤转移和进展方面提供新的见解。

关键词：肝细胞癌；侵略者；转移；miR-612；β-氧化。

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数字

图1
MiR-612和哈达它的新目标是HCC。一,b条miR-612在肝癌及其配对邻近组织中高表达和低表达的典型图像。条形图：（左）放大× 100，（右）放大倍数× 400c（c）,d日使用SPSS 22.0对肝癌患者PFS和OS进行Kaplan-Meier分析。**e（电子）**差异表达基因的火山图（纵坐标：表达变化的统计意义；横坐标：差异基因的多重变化。橙色表示上调基因，绿色表示下调基因）。**（f）**在两个独立的RNA-seq中重复下调基因。克KEGG通路分析（纵坐标：KEGG信号通路；横坐标：第页值）。小时与脂质代谢相关的基因图谱，包括哈达.我miRNA靶点双荧光素酶报告载体示意图。j个293T细胞中的萤光素酶活性。H2294:pMIR-报告哈达重量3′-UTR；H2336:pMIR报告哈达mut 3′-UTR。学生统计分析t吨测试。(***第页 < 0.001). 数据均为平均值 ± 三个独立实验的SEM

图2
miR-612和哈达.一,b条显微镜下HepG2和HCCLM3感染指示慢病毒后的形态学变化。比例尺，200μm。**c（c）**,d日电子显微镜下HepG2和HCCLM3感染指示慢病毒后的形态学变化。**e（电子）**,克感染miR-612-KD或哈达-OE慢病毒。比例尺，200μm。**（f）**,小时miR-612-OE感染HCCLM3的创面愈合哈达-KD慢病毒。比例尺，200μm。（ns：不显著*第页 < 0.05; ***第页 < 0.001). 数据均为平均值 ± 三个独立实验的SEM

图3
MiR-612通过靶向性抑制肝癌的侵袭和迁移哈达.一,b条HepG2的细胞迁移能力及统计结果^{miR-612-KD系列}和HCCLM3^{miR-612-OE型}细胞。比例尺，200μm。**c（c）**,d日HepG2的细胞侵袭能力及统计结果^{miR-612-KD系列}和HCCLM3^{miR-612-OE型}细胞。比例尺，200μm。**e（电子）**,**（f）**HepG2的细胞迁移能力及统计结果^{哈达-运行经验}和HCCLM3^{哈达-杜兰特}细胞。比例尺，200μm。克,小时HepG2的细胞侵袭能力及统计结果^{哈达-运行经验}和HCCLM3^{哈达-KD（分子量）}细胞。HepG2的细胞迁移能力及统计结果^{miR-612-KD系列}之后的单元格哈达被击倒。比例尺，200μm。我,j个HCCLM3的细胞迁移能力和统计结果^{miR-612-OE型}HADHA解救后的细胞。比例尺，50μm。k,我单元格(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01). 数据均为平均值 ± 三个独立实验的SEM。标尺，50μm

图4
MiR-612通过HADHA抑制HCC侵袭。一,**c（c）**经指定处理的HepG2细胞中侵袭性伪足相关蛋白、皮质素、F-actin和Caveolin-1的表达。一比例尺，5μm。**c（c）**比例尺，30μm(b条,d日)经指定治疗的HCCLM3细胞中侵袭性伪足相关蛋白Cortactin、F-actin和Caveolin-1的表达。b条比例尺，50μm。d日比例尺，15μm。**e（电子）**,**（f）**HCCLM3细胞侵袭性伪足的数量和统计结果。比例尺，15μm。克Western blots分析经指定处理的HepG2和HCCLM3细胞中的EMT和侵入体生物标记物

图5
HADHA促进肝癌体内转移。一利用三维合成技术对肺部转移灶进行微螺旋CT扫描。b条,**c（c）**指示的HCCLM3原位异种移植肺转移灶及其统计结果^{哈达-杜兰特}或HCCLM3^数控)H-E染色。d日,**e（电子）**H-E染色显示肝转移灶及其统计结果显示HCCLM3原位异种移植物。条形图：（左）放大× 100，比例尺，200μm。（右）放大倍数× 200，比例尺，100μm。**（f）**,克采用IHC分析法研究肝原位异种移植物中皮质素和Caveolin-1的水平。条形图：（向上）放大× 100，比例尺，200μm。（向下）放大倍数× 200.比例尺，100μm。(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01)

图6
HADHA促进肝癌中脂肪酸的β-氧化。一100μM ETO处理的HepG2细胞以及HepG2细胞中的OCR，即β-氧化活性^{miR-612-KD系列}，HepG2^{哈达-运行经验}和HepG2^数控细胞。b条OCR，即100μM ETO处理的HCCLM3细胞和HCCLM3细胞中β-氧化活性^{miR-612-OE型}，千立方厘米3^{哈达-杜兰特}和HCCLM3^数控细胞。**c（c）**用100μM ETO或100 mM亚油酸处理的HCCLM3细胞以及HCCLM3细胞的皮质素蛋白水平^miR-612-o型、HCCLM3^miR-612-i型、HCCLM3^哈达-o个和HCCLM3^哈达-我细胞。d日HCCLM3细胞内乙酰辅酶A水平^miR-612-o型、HCCLM3^哈达-我和HCCLM3^数控细胞。**e（电子）**HepG2细胞胆固醇水平^{miR-612-KD系列}、HCCLM3^{miR-612-OE型}，HepG2^{哈达-运行经验}和HCCLM3^{哈达-杜兰特}细胞。**（f）**经或不经1mM MβCD处理的HCCLM3细胞中皮质素、Caveolin-1、E-cadherin和GAPDH的蛋白水平。克HepG2中的荧光强度^miR-612-i型、HCCLM3^miR-612-o型，HepG2^哈达-o个和HCCLM3^哈达-我荧光分光光度计（Ex/Em）检测的细胞 = 360/460纳米）。荧光偏振由以下公式计算(小时)HepG2的ATP水平^{miR-612-KD系列}、HCCLM3^{miR-612-OE型}，HepG2^{哈达-运行经验}和HCCLM3^{哈达-杜兰特}用分光光度计分析细胞（λ = 636纳米）。（NS：无显著性*第页< 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001). 数据均为平均值 ± 三个独立实验的SEM

图7
肝癌患者HADHA的临床意义。一基于液相色谱-质谱（LC-MS）/MS系统对HepG2和HCCLM3细胞的胆固醇和27-羟基胆固醇进行相对定量。（NS：无显著性**第页 < 0.01; ***第页< 0.001).b条HepG2胆固醇合成途径相关蛋白的免疫印迹^{哈达-运行经验}、HCCLM3^{哈达-杜兰特}细胞及其阴性对照细胞。（用阴性对照慢病毒处理的细胞）。**c（c）**miR-612与哈达mRNA在15例肝癌及其邻近正常组织中表达。d日一名HCC患者肿瘤和瘤周组织中HADHA染色阴性和阳性的代表性图像。条形图：（左）放大× 100，比例尺，500μm（右）放大倍数× 400，比例尺，50μm。**e（电子）**134例肝癌及其配对正常组织中HADHA的平均密度。**（f）**,克使用SPSS 22.0对肝癌患者PFS和OS进行Kaplan-Meier分析。小时miR-612/HADHA/胆固醇轴调控肝癌细胞脂质重编程的假设图

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1. Siegel RL、Miller KD、Jemal A.癌症统计，2018年。CA癌症临床杂志。2018;68:7–30. doi:10.3322/caac.21442。-内政部-公共医学
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1. Vander Heiden MG、Cantley LC、Thompson CB。了解Warburg效应：细胞增殖的代谢需求。科学。2009;324:1029–1033. doi:10.1212/science.1160809。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Perez-Escuredo J、Dadhich RK、Dhup S、Cacase A、Van Hee VF、De Saedeleer CJ、Sboarina M、Rodriguez F、Fontenille MJ、Brisson L等。乳酸促进氧化癌细胞中谷氨酰胺的摄取和代谢。细胞周期。2016;15:72–83. doi:10.1080/15384101.2015.1120930。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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[3] Forner A、Llovet JM、Bruix J.肝细胞癌。柳叶刀。2012年；379:1245–1255。doi:10.1016/S0140-6736（11）61347-0。-内政部-公共医学

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