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.2020年2月6日；26（2）：277-293.e8。
doi:10.1016/j.stem.2020.01.002。

确定成人神经干细胞小生境蛋白质组确定成人神经发生的关键调节因子

雅各布·凯尔 1, 朱迪思·菲舍尔·斯坦尼克 1, 阿米莉亚·汤普森 2, 克里斯蒂安·弗里斯 3, 马修·J灰泥 4, 法维奥·萨利纳斯 5, 尤尔根考克斯 5, 大卫·C·马蒂内利 4, 乔维卡·尼科维奇 6, 克里斯蒂安·弗兰兹 2, 赫伯特·B·席勒 7, 马格达莱娜·戈茨 8
附属公司

确定成体神经干细胞小生境蛋白质组确定成体神经发生的关键调节因子

雅各布·凯尔等。 细胞干细胞. .

摘要

哺乳动物的大脑中很少有神经干细胞（NSC）能够产生新神经元，而其他区域主要是胶质生成。在这里，我们利用室管膜下区NSC生态位和嗅球的空间分离，嗅球是室管膜下区新生神经元迁移和整合的区域，并与大脑皮层相比，呈现了这些区域的综合蛋白质组特征，这不利于神经发生和新神经元的整合。我们发现神经原生态位中调节性细胞外基质（ECM）成分的不同组成。我们进一步表明，静止的神经干细胞是其局部ECM的主要来源，包括多功能酶转谷氨酰胺酶2，我们表明它对神经发生至关重要。原子力显微镜证实了蛋白质组分析的迹象，即神经源性龛比非神经源性实质更为坚硬。这些发现为揭示神经原生态位的独特组成提供了强有力的资源。

关键词：C1ql3；S100a6；大脑皮层；细胞外基质；成神经细胞；嗅球；室下区；组织硬度；转谷氨酰胺酶2；传递放大祖细胞。

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利益冲突声明

利益声明作者声明没有竞争利益。

数字

无
图形摘要
图1
图1
体感皮层和神经原生态位的高分辨率蛋白质组整合区（B）和外侧室管膜下区（SEZ）是大多数NSC所在的区域，而只有少数位于内侧室管膜下区（MEZ）（C）。切片按面板所示进行免疫染色，共聚焦z堆叠。（D） 使用无损纳米分馏进行图书馆匹配单次测量的实验工作流程。（E） SEZ和MEZ的高精度低温测定示意图。（F） 50μm冰冻冠状切面（白色，腹侧向下）的图片，去除了皮层、胼胝体和脉络丛。（F′）显示解剖区域的放大倍数，可见一条细灰色线。（G） 冰冻切片SEZ和MEZ（从纹状体[Str]和隔[Sep]分离）的显微照片，GFAP和DAPI染色（左面板），冰冻切片SEZ染色GFAP、胶原4（Col4）、髓磷脂相关糖蛋白（MAG）和DAPI（右面板）。（H） 在每个区域的库样本测量和库匹配单次激发（LMSS）样本测量中量化的蛋白质数量。数据显示为平均值±标准偏差（n=1个库样本/区域，n=4个单次采样/区域）。另请参见图S1A–S1D。（一） 每个脑区的主成分分析（PCA）。组件1和组件2分隔了主要区域。经济特区和经济特区在这些组成部分上相似。（J） 颜色表示Cx、OB和SEZ和MEZ中分别丰富的三个类别（每个类别都有FDR）。（K） 通过比较四个大脑区域，发现4786个蛋白质的热图具有不同的丰度（每个区域4个）。强度基于无监督分层聚类后的无标签量化（LFQ）强度（ANOVA与Benjamin-Hochberg事后检验，FDR=0.05）。（五十） 数据集用Uniprot关键字和矩阵体注释进行注释（见STAR方法）。然后对OB与Cx的丰富特征进行评分（0至1），并显示在条形图中（1D-注释丰富，FDR=0.05）。相反，与OB相比，负分数（0到−1）的特征在Cx中更丰富。（M） 以相同的方式分析了SEZ相对于Cx的富集特征（1D-注释富集，FDR=0.05）。面板中指示的比例尺。
图2
图2
生态位特异性ECM和NSC标记物（A）所示母体不同类别中每个大脑区域的分布图。每个蛋白质的平均LFQ强度为Z轴得分并显示在胡须图中（ANOVA、Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验，∗p=0.05，∗∗p=0.01，以及∗∗∗p＝0.001）。（B） 与SEZ和MEZ（红色）相比，基质体（黑色）和基质体的散点图显著不同（FDR≤0.1）。（C） 具有相对SEZ和OB值以及SEZ和OB强度之间的显著差异（FDR≤0.1）的散点图。这两个图都突出了在经济特区富集的S100a6和C1ql3。参见图S2B和S2C。C57BL/6J小鼠或mVenus冠状脑切片的心室、SEZ和MEZ的（D–H）显微照片/C1ql三转录报告小鼠免疫染色如图所示。注意，S100a6和C1ql3在Dcx+神经母细胞或实质星形胶质细胞中未发现，通常在室管膜细胞中也未发现。如图所示，（D）和（E）是共焦图像的z堆栈，而（F）–（H）是单个光学部分。另请参见图S3和S4A–S4I。（一）现场杂交显示SEZ中的mRNA表达。图片来源：艾伦脑科学研究所。
图3
图3
区域配对分布和神经原生态位特异性配对。我们比较了158种基质蛋白，其中78种在各自区域的分布有显著差异，其中体感皮层中细胞外基质蛋白最为丰富。当比较四个大脑区域时，热图显示基质蛋白的无监督分层聚集，且丰度显著不同（ANOVA与Benjamin-Hochberg事后检验，FDR=0.05）。不同簇的成员（由heatmap右侧的条表示）列在heatmap的进一步右侧的彩色区域中。
图4
图4
利用体感皮层和神经原生态位的深层定量蛋白质组进行隔间分析（A）通过逐步脱细胞，我们确定了ECM和其他细胞隔间相关蛋白的不溶性和各种扩散等级。（B） 所有区域（顶部、黑色和灰色）的量化蛋白质总数，以及大脑三个区域（底部、颜色）中每一个清洁剂部分的量化蛋白质。每个样本分数显示为平均值±标准偏差（每个大脑区域的n=4）。（C） 显示类别中蛋白质的溶解度概况和分布图。丰富的资源Z轴对胡须图中显示的这些类别中的每个蛋白质进行评分，然后取其平均值，并在图中显示每个类别中的蛋白质数量。不溶性蛋白质向组分4分布较多，可溶性蛋白质向组份1分布较多（用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验分析显著性）。另请参见图S2G、S5A和S5B。（D） 三个区域之间溶解度差异显著的1216个蛋白质的热图（FDR≥0.05）。（E和F）使用第四部分LFQ强度的相对差异（1D-注释富集，FDR=0.05），与Cx相比，OB中更可溶（E）和不可溶（F）蛋白质的特征显著丰富。数据集使用Uniprot关键字、矩阵体和自定义神经网络注释进行注释（参见STAR方法）。（G） 从OB中相对较易溶解和不溶的蛋白质中，我们显示了核基质层粘连蛋白和神经发生相关蛋白的定量分布（双向方差分析）。数据以平均值±SEM表示。（H）具有显著不同溶解度分布的配对蛋白质，用于比较三个大脑区域(Z轴LFQ强度值评分，双向方差分析，p≥0.05）。行经历了无监督的层次聚类。
图5
图5
脑-和生态位-基质组成（A）基质蛋白溶解度分布图是通过使用洗涤剂溶解度曲线的无监督分层聚类来显示的，这些曲线是由平均值得出的Z轴每个大脑区域（Cx、OB和SEZ）的得分。（B–D）SEZ相关ECM蛋白（B）Tenascin-C（Tnc）、凝血酶原反应蛋白-4（Thbs4）和Plexin-b2（Plxnb2）的洗涤剂溶解度曲线；OB相关蛋白（C）Tenascin-R（Tnr）、Reelin（Reln）和Ptn（Ptn）；以及两种神经原壁龛特异性蛋白（D）S100a6和C1ql3（p=0.0948）。数据以平均值±SEM表示。（E）晶须图中显示Cx-、SEZ-和OB-富集基质蛋白的溶解度曲线（方差分析，图表中的p值）。
图6
图6
转谷氨酰胺酶2促进神经发生（A）神经干细胞被鉴定为SEZ中用Tgm2复染的hGFAP-GFP+细胞，并插入左侧低倍照片中的虚线所示的右侧。神经干细胞和室管膜细胞均用Tgm2标记。左心室，侧脑室。（B） SEZ的整体切片显示室管膜细胞之间的hGFAP-GFP+Tgm2+心尖端足，由β-catenin+连接描绘。（C） SEZ冠状面单面共焦照片，Dcx和Tgm2免疫染色显示无双阳性细胞。（D） 通过荧光激活细胞分选（FACS）从SEZ分离的细胞中用qRT-PCR分析Tgm2的表达。通过hGFAP-eGFP+和顶膜标记物CD133+鉴定NSC，室管膜细胞（EP）为hGFAP-GFP-/CD133+和hGFAP-GFP+，CD133-、PSA-NCAM-、EGFR-细胞为小生境星形胶质细胞（NA）。注意，神经干细胞和室管膜细胞表达高水平的Tgm2型mRNA。NSCs的直接子代，即传递扩增祖细胞（TAPs），分离为EGFR+、CD133-、PSA-NCAM-，以及神经母细胞，分离为PSA-NCAM+，也几乎不表达Tgm2。数据表示为平均值±标准偏差。（E） SEZ染色的原代培养显示Tgm2+细胞也是GFAP+。（F） 在用Z-DON（不可逆Tgm2抑制剂）或Boc-DON（细胞膜不透性和不可逆Tgm2抑制剂）抑制Tgm2后，进行原代SEZ培养和克隆分析的实验装置。（G） 电镀后4小时的10-μM Z-DON处理显著减少了逆转录病毒标记的细胞簇（克隆，即共享原始细胞的细胞簇）的数量，而100-μM Boc-DON没有改变克隆的数量。数据表示为平均值±SEM。∗p≤0.05，双尾Mann-Whitney检验。（H） 使用Z-DON，但不使用Boc-DON，含有新生成的成神经细胞（Dcx+）的GFP+克隆的比例降低，而来自NSC的混合克隆和胶质克隆的比例则相反增加。数据以平均值±SEM、双向方差分析和Bonferroni的多重比较试验表示，∗∗p≤0.01和∗**p≤0.001。（一） 如图所示，由神经元、胶质细胞和混合细胞类型组成的逆转录病毒标记（CAG-IRES-GFP）克隆的示例。比例尺如图所示。（J） 用10-nM siRNAs对抗Tgm2对原代SEZ培养物进行处理，与对照组（干扰siRNA）相比，神经元克隆数量减少（n=4，数据表示为平均值±SEM，双向方差分析与Bonferroni的多重比较试验，∗p≤0.05）。（K） 代表性瓷砖的DAPI染色计数（n=4，每个n中计数9块瓷砖）。（L） 渗透泵实验的实验装置，分为4天和7天两个时间点，在人工脑脊液中连续心室内输注100μM Z-DON。（M） 在输注的对侧，我们量化了在SEZ为Dcx+或Dcx−的EdU+细胞。Z-DON治疗4天后，我们发现TAP显著减少（EdU+/Dcx−），而增殖神经母细胞（EdU+/Dcx+）与对照组相似（数据以平均值±SEM表示）。∗p≤0.05，双尾t检验）。治疗7天后，这种趋势继续存在（数据以平均值±SEM表示。p=0.0537，双尾t检验）。每个大脑对来自6个切片的共聚焦图像堆栈进行量化。
图7
图7
神经原生态位的较高刚度（A）AFM冠状切片（300μm）刚度测量示意图。（B） 对SEZ、MEZ、纹状体和Cx的僵硬度进行评估。两个心室区域的僵硬程度显著高于组织僵硬程度相似的Cx和纹状体。经济特区明显比经济特区僵硬。数据显示为晶须图，∗p=0.05和∗∗p=0.01。（C） 如图所示，OB测量的代表性组织热图和比例尺。（D） 在OB中，RMS末端的僵硬程度低于相邻的嗅道。颗粒细胞层（GCL）、内外丛状层（IPL/EPL）和肾小球层（GL）更加坚硬。数据显示为胡须图，Mann-Whitney检验（双尾），∗p=0.05和∗∗∗p=0.001。（E） 将初级SEZ培养物涂敷在刚度为100-Pa或200-Pa的水凝胶上的实验装置。（F） 在5天实验期结束时，DAPI细胞的数量相似。（G） 电镀后5天Dcx+细胞的代表性图像。（H） 与100 Pa刚度水凝胶上相同的SEZ原代培养相比，具有200-Pa刚度的水凝胶显著增加了Dcx+细胞的百分比。数据表示为平均值±标准偏差。∗p=0.05，配对t检验。
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