跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2020年2月4日；30（5）：1478-1490.e6。
doi:10.1016/j.celrep.2019.11.040。

Oct4-介导的Lsd1活性抑制促进多能增强剂的活性和启动状态

喇嘛阿卜迪 1, 德巴里娅·萨哈 1, 明和 1, 穆赫德·萨利姆·达尔 1, 萨加尔·M·乌特图尔克 2, 普图阿尤·苏迪亚蒂 三, 斯蒂芬·麦库恩 1, Brice H长矛 1, 詹姆斯·布雷德洛夫 1, 纳迪娅·兰曼 4, 胡迈拉·戈沃尔 5
附属公司

Oct4-介导的Lsd1活性抑制促进多能增强剂的活性和启动状态

喇嘛阿卜迪等。 单元格代表. .

摘要

由于增强子再激活导致多能性基因（PpG）表达异常增加，可诱导干细胞生成并增强肿瘤干细胞的致瘤性。胚胎干细胞分化过程中PpG增强子（PpGe）的沉默涉及Lsd1介导的H3K4me1去甲基化和DNA甲基化。在这里，我们观察到H3K4me1在PpGe的保留和DNA低甲基化与F9胚胎癌细胞（ECCs）分化后PpGs的部分抑制相关。F9 ECCs中的H3K4me1去甲基化不能被Lsd1过表达所挽救。鉴于我们观察到H3K4me1去甲基化在P19 ECC中伴随着强烈的Oct4阻遏，我们测试了Oct4与Lsd1的相互作用是否影响其催化活性。我们的数据显示Oct4对Lsd1活性的剂量依赖性抑制以及Oct4过度表达P19 ECCs时H3K4me1在PpGe的保留。这些数据表明，肿瘤干细胞中Lsd1-Oct4的相互作用可以建立一种“启动”增强子状态，该状态容易被激活，导致异常PpG表达。

关键词：DNA甲基化；Dnmt3a；Lsd1；10月4日；肿瘤干细胞；胚胎癌细胞；增强剂启动；增强子；组蛋白去甲基化；多能性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明作者声明没有竞争利益。

数字

图1。
图1.胚胎癌细胞中的多能性基因部分被抑制
（A、B和E）通过qRT-PCR对（A）F9 ESCs、（B）ECCs和（E）F9 ECCs谱系特异性基因中的PpGs进行基因表达分析。将每个基因的阈值循环（Ct）值标准化为盖普，表达与未分化细胞（虚线）相对。在F9 ECCs中，谱系特异性基因显示出5到60倍的基因表达诱导（E），而PpGs的表达平均减少到约50%的分化后（B）。显示了每个基因的两个生物复制的平均值和SEM。ESCs和F9 ECCs分化前后的（C和D）碱性磷酸酶染色（C）和SSEA-1免疫荧光（D）。阳性信号表示ESCs分化后失去多能性。比例尺，100μm。UD，未分化；D4和D8，诱导分化后第天；胚胎干细胞；F9 ECCs、F9胚胎癌细胞；PpGs，多能性基因。
图2。
图2多能性基因增强剂不能在胚胎癌细胞中获得DNA甲基化
（A-C）使用Bis-seq进行DNA甲基化分析。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，PCR扩增PpGe区域。在高通量测序平台（Wide-Seq）上对扩增产物进行测序，并使用Bismark软件对数据进行分析。（A）ESCs和（B）F9 ECCs分化前后PpGe的DNA甲基化。F9 ECC中记录到的DNA甲基化不足10%，作为对照的H19印迹区域显示DNA甲基化为80%。在相同的区域，ESCs中的DNA甲基化增加了30%。另请参见图S1A。（C） 过度表达Myc-Dnmt3a的F9 ECCs中PpGe的DNA甲基化。（D） 通过qRT-PCR PpGs分析分化前后过度表达Myc-Dnmt3a的F9 ECCs的基因表达。（C） 在大多数PpGe中，DNA甲基化水平较低（低于10%），并且（D）在8个测试的PpGs中，有5个的表达没有显著下降（p>0.1）。C类t吨将每个基因的值标准化为Gapdh，并显示相对于未分化细胞的表达（虚线）。（E） 通过甲基RAD测序进行全基因组DNA甲基化分析。用限制性内切酶消化基因组DNAFsp公司EI将甲基化DNA切割成31-32 bp的片段。这些片段被测序并绘制在mm10小鼠基因组上。每个区域的读取次数被用作DNA甲基化程度的衡量标准，并在未分化和D4分化的F9 ECCs之间进行比较。瀑布图显示了PpGe处的DNA甲基化变化，这是通过从未分化样品中的标准化计数减去D4样品中的规范化计数来计算的。在阈值区域中使用上四分位数和下四分位数来表示甲基化的获得或丢失。饼图显示了PpGe随DNA甲基化（NCDM）增加、减少或无变化的分数。另请参见图S2B。（F） 在与NCDM增强子相关的基因中，前十个具有统计学意义的丰富典型路径没有变化。x轴显示log10（调整后的p值），其中p值使用Benjamini-Hochberg方法进行多次测试调整。（A）-（D）的数据是两个生物复制品的平均值和SEM。UD，未分化；D4和D8，诱导分化后第天；D8 UT，未转染F9 ECCs分化8天；D8+Myc-Dnmt3a，F9 ECCs过度表达Myc-Dnm t3a并分化8天；胚胎干细胞；F9 ECCs、F9胚胎癌细胞；PpGe，多能性基因增强子。
图3。
图3.在胚胎癌细胞的多能性基因增强子处建立了“引物”染色质状态
染色质免疫沉淀（ChlP）-qPCR分析。F9 ECCs分化前和分化后D4中PpGe（A）H3K27Ac和（B）H3K4me1的组蛋白修饰。PpGe的去乙酰化被观察到是H3K27Ac信号的减少，组蛋白H3K4me1在分化后仍保留。（C） 未分化ESC和F9 ECC中的Lsd1占用率。（D和E）与未分化转染细胞相比，表达重组FLAG-Lsd1的F9 ECC中（D）H3K4me1和（E）H3K4me2的富集。转染Lsd1表达质粒24小时后，分化ECCs。虽然在某些PpGe（D）中H3K4me1增加，但H3K4me2富集（E）同时减少。（F） pargyline处理和未处理、WT和FLAG-Lsd1在分化后D4过度表达F9 ECCs的PpGe处H3K4me1富集的折叠变化。褶皱变化表示为相对于未分化状态下的富集（虚线）。%浓缩=输入x 100上的倍数浓缩。p值来源于Student t检验：*p<0.05**p<0.01***p<0.005。UD，未分化；D4，诱导分化后天数；D4+FLAG-Lsd1、F9 ECCs过度表达FLAG-Lsd1并分化4天；Prg，pargyline；多能性基因增强子。所有实验都是至少两次生物复制的平均值，误差如SEM所示。
图4。
图4胚胎癌细胞中H3K4me1在多能性基因增强器中的整体保留
用ChlP-seq测定F9 ECCs分化前后的全基因组H3K4me1水平。对每个输入-ChIP对使用Epic2执行峰值调用。在F9 ECC中，在ESCs中之前注释的PpGe的1 kbp范围内，共鉴定出1425个H3K4me1峰（Whyte等人，2012）。另请参见图S5A。通过计算D4分化和未分化样品在PpGe处H3K4me1峰富集的变化，推测Lsd1的组蛋白去甲基化活性。（A） 瀑布图表示H3K4me1的变化，其计算为D4和未分化样品的log2FC之间的差异，并转换为Z轴分数。Z轴分数阈值+1和-1用于定义饼图中H3K4me1增加、无变化或减少的分数。综上所述，87%PpGe在H3K4me1富集中显示增加或无变化（NDCM）。（B和C）维恩图显示PpGe之间的重叠，显示（B）F9 ECC中峰值富集增加或（C）无变化，但在ESCs分化后经历组蛋白H3K4me1去甲基化（Whyte等人，2012）。（D） 在与F9 ECC增加和无变化相关的基因中，前十个具有统计学意义的丰富典型路径。x轴显示log-10（调整后的p值），其中p值使用Benjamini-Hochberg方法进行多次测试调整。（E） PpGe之间的重叠显示DNA甲基化（NDHM）没有变化，而Pp锗显示H3K4me1（NCDM）没有减少。胚胎干细胞；F9 ECCs、F9胚胎癌细胞；PpGe，多能性基因增强子；D4，诱导分化后的天数。
图5。
图5 P19胚胎癌细胞中的多能性基因增强子被停用
（A） P19ECCs中PpGs的qRT-PCR基因表达分析。C类t吨每个基因的值被标准化为盖普，表达与未分化细胞（虚线）相对。与ESCs中PpG的抑制类似（图1A），PpG，尤其是Oct4和Nanog的表达减少了90%以上。（B） ChlP-qPCR显示H3K4me1在UD和D4分化的P19 ECCs中富集。在所有PpGe分化后观察到H3K4me1的降低，表明组蛋白去甲基化活性。%浓缩倍数=输入倍数×100。（C） 在UD、D4和D8分化的P19ECC中使用Bis-seq对PpGe进行DNA甲基化分析。在五分之三的PpGe分化后观察到DNA甲基化水平增加了40%。所有实验都是至少两次生物复制的平均值，误差显示为SEM.UD，未分化；分化诱导后的第D4和D8天；P19 ECCs、P19胚胎癌细胞；PpGs，多能性基因；PpGe，多能性基因增强子。
图6。
图6..Oct4与Lsd1相互作用并抑制其催化活性
（A） 使用未分化和D4分化F9 ECC的核提取物与抗Oct4抗体和对照免疫球蛋白G（IgG）进行coIP。在蛋白质印迹上检测10%的coIP输入物和洗脱液中的Oct4和Lsd1。垂直空间表示凝胶中数字移除的额外通道。（B） 谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉实验显示Lsd1和Oct4之间存在直接相互作用。重组GST-Lsd1与Oct4以约1:2摩尔比孵育，并使用GST-Sepharose沉淀。使用抗Oct4抗体检测共沉淀Oct4。垂直空间表示凝胶中数字移除的额外通道。（C） 使用0.25μM Lsd1和H3K4me2肽作为底物进行Lsd1脱甲基酶分析。在反应中，0.1 mM TCP（tranylcypromine）完全抑制Lsd1脱甲基活性。为了测试Oct4对Lsd1活性的影响，在存在0.5μM Oct4 ata1:2（Lsd1:Oct4）摩尔比的情况下进行脱甲基分析。以相同摩尔比的Dnmt3a催化域作为对照。（D） 使用浓度增加的Oct4进行剂量依赖性抑制试验，其摩尔比为Lsd1:Oct4:（1:0.5），（1:1），（1:2），，（1:3），（1:4）。数据是至少5个实验重复的平均值和SD。（E） 使用0.25μM Lsd1和30 mg大块组蛋白作为底物，随着反应中Oct4浓度的增加，进行Lsd1去甲基化分析。上面板：使用抗H3K4me2的蛋白印迹检测组蛋白去甲基化，这表明随着Oct4浓度的增加，信号保持不变。下部面板：组蛋白去甲基化反应中Lsd1酶的量和Oct4的增加量。大块组蛋白的Ponceau S染色显示凝胶上的负载相等。右侧的条形图显示了使用ImageJ软件对H3K4me2信号的量化。（F） ChIP-qPCR显示H3K4me1在P19 ECC中PpGe处的富集百分比，稳定表达分化前和分化后的重组Myc-Oct4。数据显示分化后H3K4me1的保留率。%富集=通过qRT-PCR对表达重组Myc-Oct4的P19 ECCs中PpGs的输入x 100（G）基因表达分析进行倍富集。Ct值标准化为盖普，表达与未分化细胞（虚线）相对。（H） 使用UD和D4中的Bis-seq对PpGe进行DNA甲基化分析，区分P19 ECCs WT并表达重组Myc-Oct4。与未转染的WT相比，表达Oct4的细胞在PpGe分化后未能获得DNA甲基化。所有实验都是至少两次生物复制的平均值，误差显示为SEM。TCP，tranylcypomine；胚胎癌细胞；PpGe，多能性基因增强子；D4，诱导分化后天数。
图7。
图7.干细胞分化过程中多能性基因增强器的表观遗传变化模型
</p>在未分化状态下，多能性基因增强子（PpGe）是活性的，由辅激活物复合物结合，并含有染色质修饰，包括H3K4m2/1和H3K27Ac。作为对分化信号的响应，辅激活子复合物（包括Oct4）的解离后，Lsd1-Mi2/NuRD复合物的活性增强，这有助于增强子沉默。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）在PpGe处去除H3K27Ac，Lsd1去甲基化H3K4me1，然后通过Dnmt3a进行DNA甲基化。然而，在F9 ECCs中，Lsd1活性在Oct4的存在下被抑制，导致H3K4me1滞留。Dnmt3a的ADD结构域不能与H3K4甲基化组蛋白尾部相互作用，并可能保持在自动抑制状态，从而阻止这些位点的DNA甲基化。因此，PpGe不是被沉默，而是获得一个“素数”状态。黑色别针代表甲基化CpG。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Akhtar-Zaidi B、Cowper-Sal-lari R、Corradin O、Saiakhova A、Bartels CF、Balasubramanian D、Myeroff L、Lutterbaugh J、Jarrar A、Kalady MF等（2012）。表观基因组增强子分析定义了结肠癌的特征。科学336736-739。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Alonso A、Breuer B、Steuer B和Fischer J.（1991）。F9-EC细胞系作为分化分析的模型。国际开发生物学杂志。35, 389–397.-公共医学
    1. 安德鲁斯·S（2010）。FastQC：用于高通量序列数据的质量控制工具。http://www.bioinformatics.abraham.ac.uk/projects/fastqc生物信息系统.
    1. Andrews PW、Matin MM、Bahrami AR、Damjanov I、Gokhale P和Draper JS（2005年）。胚胎干（ES）细胞和胚胎癌（EC）细胞：同一硬币的反面。生物化学。社会事务处理。33, 1526–1530.-公共医学
    1. Aran D和Hellman A.（2013年）。转录增强因子的DNA甲基化与癌症易感性。754号牢房，11–13。-公共医学

出版物类型