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.2020年1月28日；10(1):1281.
doi:10.1038/s41598-020-57997-6。

血小板通过子宫内膜异位基质细胞中的NF-κB和TGF-β1信号通路诱导雌激素产生增加

丘明奇 # 1, 刘西施 # 1 2, 张琦 1, 孙伟国 三 4
附属公司

血小板通过NF-κB和TGF-β1信号通路诱导子宫内膜异位基质细胞雌激素分泌增加

丘明奇等。 科学代表. .

摘要

子宫内膜异位症是雌激素依赖性疾病。两种理论为雌激素分泌增加提供了解释。一种是将炎症和雌激素产生联系起来的前馈回路模型。较新的模型反映了子宫内膜碎片脱落后回流到腹膜腔导致的组织缺氧。这两种模型都默认子宫内膜异位基质细胞内发生了一切，似乎不需要外源性因素。本研究旨在探讨血小板是否可能是局部雌激素过度分泌的原因。我们采用体外实验评估17β-雌二醇（E2)活化血小板处理的子宫内膜异位基质细胞中的水平，StAR、HSD3B2、芳香化酶和HSD17B1的基因和蛋白表达水平，以及它们的上游基因/蛋白，如NF-κB、TGF-β1、HIF-1α、SF-1和磷酸化CREB。此外，我们进行了2次动物实验，使用血小板耗竭/输注以及NF-κB和TGF-β1的中和作用，随后对StAR、HSD3B2、芳香化酶和HSD17B1以及SF-1和p-CREB的参与进行免疫组织化学分析。我们发现通过活化血小板治疗子宫内膜异位基质细胞可以增加E2产量增加4.5倍，同时StAR、HSD3B2、芳香化酶和HSD17B1这四个对雌激素合成重要的基因/酶及其上游基因HIF-1α、SF-1和磷酸化CREB的基因和蛋白表达增加。此外，血小板通过激活NF-κB和/或TGF-β1来激活这些基因，任何一种信号通路的拮抗作用都可以消除这4个基因的诱导，从而增加雌激素的产生。两次动物实验证实了这些变化。因此，血小板增加E2通过激活NF-κB和/或TGF-β1上调StAR、HSD3B2、芳香化酶和HSD17B1，在子宫内膜异位基质细胞中产生。这些发现提供了另一个令人信服的证据，证明子宫内膜异位病变确实是反复组织损伤和修复的伤口。他们强烈表明，非激素治疗子宫内膜异位症在理论上是可行的，抗血小板治疗是一种有希望的途径。

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数字

图1
图1
用活化血小板治疗HESC导致E生成增加2通过类固醇生成基因的上调。(A类)E的浓度2HESC上清液中（n = 7） 和ESCL（n = 5） 用PBS、血小板、活化血小板和凝血酶单独治疗。基因(B类)和蛋白质(D类)雌激素生物合成相关基因的表达水平：StAR、CYP11A1、HSD3B2、CYP17A1、CYP19A1和HSD17B1，在与PBS、血小板、活化血小板和凝血酶共同培养的HESC中。(C类)StAR、HSD3B2、芳香化酶和HSD17B1的代表性蛋白质印迹结果。SF-1的折叠变化(E类)和p-CREB(F类)与PBS、活化的血小板和单独的凝血酶共培养的HESC中的蛋白质表达。“*”表示指定治疗和PBS治疗之间的差异p值小于0.05。使用的缩写：PLT：血小板；A.PLT：活化血小板；THMB：凝血酶。采用配对Wilcoxon试验。
图2
图2
活化的血小板激活NF-κB，抑制NF-κ的激活可消除血小板诱导的HIF-1α、COX-2和VEGF的上调。(A类)HESC中磷酸化p65的典型蛋白质印迹结果（n = 8） 与PBS（缓冲液）、血小板、活化血小板和凝血酶共培养(B类)Western blot结果总结。(C类)HESC中HIF-1α、COX-2和VEGF mRNA丰度的折叠变化（n = 8） 与载体、活化血小板和活化血小板共培养 + JSH-23。(D类)与载体、活化血小板和活化血小板共同培养的HESC中HIF-1α、COX-2和VEGF的典型Western blotting结果和折叠变化 + JSH-23。(E类)蛋白质印迹结果摘要。“*”表示组间差异的p值小于0.05。N或NS:p > 0.05. 缩写：A.PLT：活化血小板。采用配对Wilcoxon检验。
图3
图3
JSH-23抑制NF-κB活化对E生成的影响2和类固醇生成基因在HESC中的表达。(A类)E的浓度2HESC上清液中（n = 8） 用载体、活化血小板和活化血小板治疗 + JSH-23。(B类)与载体、活化血小板和活化血小板共培养HESC中雌激素生物合成相关基因StAR、HSD3B2、CYP19A1和HSD17B1的基因表达水平 + JSH-23。(C类)StAR、HSD3B2、芳香化酶和HSD17B1蛋白表达的代表性蛋白质印迹结果。(D类)HESC中StAR、HSD3B2、芳香化酶和HSD17B1蛋白表达水平的倍数变化总结（n = 8） 用载体、活化血小板和活化血小板治疗+JSH-23。SF-1褶皱变化汇总(E类)和p-CREB(F类)HESC中的蛋白质表达（n = 8） 用载体、活化血小板和活化血小板治疗 + JSH-23。“*”表示组间差异的p值小于0.05。国家标准：p > 0.05. 采用配对Wilcoxon检验。
图4
图4
A83-01中和TGF-β1对血小板诱导的HIF-1α、COX-2和VEGF基因和蛋白表达的影响。(A类)HESC中HIF-1α、COX-2和VEGF mRNA丰度的折叠变化（n = 8） 用载体、活化血小板和活化血小板治疗 + A83-01。(B类)HESC中HIF-1α、COX-2和VEGF蛋白表达的代表性蛋白质印迹结果（n = 8） 与载体、活化血小板和活化血小板共培养 + A83-01和(C类)褶皱变化总结。“*”表示组间差异的p值小于0.05。生理盐水：p > 0.05. 采用配对Wilcoxon检验。
图5
图5
A83-01中和TGF-β1对E生成的影响2HESC中类固醇生成相关基因的表达。(A类)E的浓度2HESC上清液中（n = 8） 用载体、活化血小板和活化血小板治疗 + A83-01。(B类)HESC中StAR、HSD3B2、CYP19A1和HSD17B1的基因表达水平（n = 8） 用载体、活化血小板和活化血小板治疗+A83-01。(C类)不同处理下HESC中StAR、HSD3B2、芳香化酶和HSD17B1的典型蛋白质印迹结果。(D类)HESC中StAR、HSD3B2、芳香化酶和HSD17B1蛋白表达水平的倍数变化总结（n = 8） 用载体、活化血小板和活化血小板治疗 + A83-01。SF-1的Western blot分析结果(E类)和p-CREB(F类)用载体、活化血小板和活化血小板处理的HESC中的蛋白质 + A83-01。“*”表示组间差异的p值小于0.05。生理盐水：p > 0.05. 采用配对Wilcoxon检验。
图6
图6
非免疫血清（NI）、血小板输注（PI）和血小板耗竭（PD）对诱导子宫内膜异位症小鼠病变发展和类固醇生成蛋白表达的影响。(A类)在指定时间测试的NI、PD和PI组小鼠的热板潜伏期的变化。(B类)3个治疗组小鼠的总损伤重量。NI、PD和PI组病变染色水平的箱线图：StAR(C类)、HSD3B2(D类)、芳香化酶(E类)，HSD17B1(F类)，SF-1(G公司)和p-CREB(H（H）). 水平虚线表示所有三组的中间值。统计显著性符号：*：p < 0.05，**:p < 0.01，***：p < 0.001. n个 = 每组10人。除了在(A类)在使用Kruskal检验进行比较的情况下，所有检验均使用Wilcoxon检验与NI组进行比较。(我)不同治疗组诱导子宫内膜异位症Balb/c小鼠子宫内膜异位病变（×400）中StAR、HSD3B2、芳香化酶、HSD17B1、SF-1和p-CREB染色的代表性显微照片。比例尺 = 50微米。
图7
图7
TGF-β1（通过SB431542）或NF-κB（通过JSH-23）拮抗诱导子宫内膜异位症小鼠的病变发展和类固醇生成蛋白的病变表达的作用。(A类)在指定时间测试小鼠用载体（未经处理或U）治疗的热板潜伏期变化、TGF-β1（T）拮抗作用和NF-κB（N）拮抗作用。(B类)3组小鼠的总损伤重量。(C类)使用CD41对3组小鼠进行损伤血小板聚集程度的箱线图。三组小鼠病变染色水平的箱线图：StAR(D类)、HSD3B2(E类)、芳香化酶(F类)，HSD17B1(G公司)，SF-1(H（H）)和p-CREB(我). 水平虚线表示所有三组的中间值。具有统计学意义的符号：*：p < 0.05，**:p < 0.01，***：p < 0.001. 生理盐水：p > 0.05. n个 = 每组10人。除了在(A类)在使用Kruskal试验进行比较的情况下，所有试验均使用Wilcoxon试验与未治疗组进行比较(U型). (J型)诱导子宫内膜异位症Balb/c小鼠子宫内膜异位病变（×400）中CD41、StAR、HSD3B2、芳香化酶、HSD17B1、SF-1和p-CREB的代表性免疫反应染色，然后用载体SB431542（TGF-β1拮抗剂）和JSH-23（NF-κB拮抗剂）治疗两周。比例尺 = 50微米。
图8
图8
描述子宫内膜异位症中血小板诱导雌激素生物合成的示意图。活化血小板在子宫内膜异位病变中诱导NF-κB信号通路和TGF-β1/Smad3信号通路的激活。这两条信号通路调节编码缺氧和炎症分子的几个基因，如HIF-1α、COX-2和VEGF——在HESC中血小板治疗后上调。HIF-1α和VEGF的高表达表明，活化血小板在子宫内膜异位病变中诱导缺氧。HIF-1α积累增加导致DUSP2下调，导致ERK和p38 MAPK激活时间延长，子宫内膜异位基质细胞COX-2表达增加，ERβ表达增加，这也可能由活化的血小板诱导。COX-2过度表达导致PGE的产生增加2子宫内膜异位症，进一步有利于E2HESC合成。当地E水平较高2（通过ERβ）和PGE2反过来可能进一步放大COX-2的表达，从而导致类固醇基因的过度表达，并持续产生E2和PGE2子宫内膜异位组织中。前列腺素E2通过受体EP2或EP4增加细胞内cAMP水平。升高的cAMP上调SF-1并增强其与甾体生成基因启动子的结合，以及PKA的激活，导致CREB磷酸化，从而促进其与StAR、芳香化酶或其他一些甾体形成基因启动子区域上的cAMP-响应元件（CRE）的结合,，并作为启动子展开DNA-组蛋白结合，然后为C/EBP与这些类固醇基因启动子的结合提供空间。PGE公司2-在子宫内膜异位基质细胞中，诱导的StAR启动子活性似乎由CREB和C/EBPβ协同调节。前列腺素E2通过PKA信号通路负调控AMPK，CREB和相关蛋白也是AMPK的直接下游靶点。AMPK对通过磷酸化激活CREB至关重要，AMPK在CREB的表达中具有负调控作用。CRTC2转位到细胞核中，与CREB形成转录复合物。AMPK可以直接磷酸化CRTC家族成员。在缺乏AMPK活性的情况下，CRTC2去磷酸化并转移到细胞核，与CREB结合，然后增加靶基因的表达。活化血小板还通过下调HESC中AMPK的磷酸化水平来抑制AMPK激活（Qi等.，未发表的数据），其可以进一步激活CREB与HESC中的类固醇生成基因的结合。此外，据报道，USF2与SF-1启动子结合，刺激SF-1及其靶基因的表达，最近的研究表明，FXR与CREB竞争结合CYP19A1启动子区域，导致芳香化酶表达下调。孕酮通过激活基质PR-B诱导上皮细胞HSD17B2的表达，基质可以介导维甲酸的形成与启动子结合，从而激活HSD17B2。在子宫内膜异位组织中，基质细胞中PR-B表达降低会干扰孕酮的旁分泌作用。ERβ抑制ERα和PR-B，导致孕酮抵抗和E失活不足2子宫内膜异位病变。使用的缩写：AA：花生四烯酸，PGE2：前列腺素E2，RA：维甲酸，COX-2：环氧合酶-2，A：雄烯二酮，E1：雌酮，E2：雌二醇，P：孕酮，SF-1：类固醇生成因子-1，CREB：cAMP反应元件结合蛋白，StAR：类固酮生成急性调节，P450scc：细胞色素P450侧链裂解，HSD3B2：3-羟基类固醇脱氢酶2型，P450c17：细胞色素P450 17α-羟化酶/17，20-裂解酶，HSD17B1：17β-羟基类固酮脱氢酶1型，HSD17B 2:17-β-羟基类固醇脱氢酶2型。ER-α：雌激素受体-α；ER-β：雌激素受体-β。PR-B：孕酮受体B，ERK：细胞外信号调节激酶，AMPK：AMP-活化蛋白激酶，CRTC2:CREB-调节转录辅活化因子2，C/EBPβ：CCAAT/增强子结合蛋白β，USF2：上游刺激因子2，FXR：法尼类X受体。
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