Transmissible gastroenteritis virus targets Paneth cells to inhibit the self-renewal and differentiation of Lgr5 intestinal stem cells via Notch signaling

doi:10.1038/s41419-020-2233-6

.2020年1月20日；11(1):40.

doi:10.1038/s41419-020-2233-6。

传染性胃肠炎病毒通过Notch信号途径靶向Paneth细胞抑制Lgr5肠干细胞的自我更新和分化

吴爱民^#^1 2, 冰雨^#^1 2, 张可英^1 2, 徐志文^三, 德武^1 2, 何骏^1 2, 罗俊秋^1 2, 罗玉恒^1 2, 洁余^1 2, 郑萍（Ping Zheng）^1 2, 联强车^1 2, 毛向兵^1 2, 黄志清^1 2, 王岚（Lan Wang）^1 2, Jun Zhao（赵军）^三, 陈黛文^4 5

附属公司

¹四川农业大学动物营养研究所，中国成都。
²中国教育部动物抗病营养重点实验室，四川农业大学，成都。
^三四川农业大学兽医学院，中国成都。
⁴四川农业大学动物营养研究所，中国成都。dwchen@sicau.edu.cn。
⁵中国教育部动物抗病营养重点实验室，四川农业大学，成都。dwchen@sicau.edu.cn。

^#贡献均等。

PMID： 31959773
预防性维修识别码： PMC6971083型
内政部： 10.1038/s41419-020-2233-6

传染性胃肠炎病毒通过Notch信号途径靶向Paneth细胞抑制Lgr5肠干细胞的自我更新和分化

吴爱民等。细胞死亡病. 2020.

.2020年1月20日；11(1):40.

doi:10.1038/s41419-020-2233-6。

作者

吴爱民^#^1 2, 冰雨^#^1 2, 张可英^1 2, 徐志文^三, 德武^1 2, 何骏^1 2, 罗俊秋^1 2, 罗玉恒^1 2, 洁余^1 2, 郑萍（Ping Zheng）^1 2, 车连强^1 2, 毛向兵^1 2, 黄志清^1 2, 王岚（Lan Wang）^1 2, Jun Zhao（赵军）^三, 陈黛文^4 5

附属公司

¹四川农业大学动物营养研究所，中国成都。
²中国教育部动物抗病营养重点实验室，四川农业大学，成都。
^三四川农业大学兽医学院，中国成都。
⁴四川农业大学动物营养研究所，中国成都。dwchen@sicau.edu.cn。
⁵中国教育部动物抗病营养重点实验室，四川农业大学，成都。dwchen@sicau.edu.cn。

^#贡献均等。

PMID： 31959773
预防性维修识别码： PMC6971083型
内政部： 10.1038/s41419-020-2233-6

摘要

传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染与48小时内绒毛萎缩有关，严重破坏肠道内稳态。然而，潜在的机制仍然难以捉摸。在这项研究中，我们发现TGEV感染通过抑制Lgr5肠干细胞（ISCs）的自我更新和分化严重破坏了肠内稳态。更深刻的是，TGEV编码的NSP10/NSP16蛋白复合物介导了Notch信号的失活，为这一现象提供了一种机制解释。TGEV最初通过氨肽酶N（APN）受体攻击Paneth细胞，然后在其中诱导线粒体损伤和ROS生成，最终导致Paneth淋巴细胞减少和Notch因子（DII4和Hes5）丢失，这些因子对Lgr5 ISCs自我更新和分化至关重要。有趣的是，Notch信号的丢失以吸收性肠细胞为代价诱导杯状细胞分化，并促进粘蛋白分泌，从而加速TGEV复制。因此，杯状细胞分化程度越高，空肠TGEV感染越严重。这些结果提供了TGEV感染的空肠在48小时内迅速发生绒毛萎缩的详细机制。因此，TGEV的发病机制可以描述为“自下而上的情况”，这与传统的“自上而下”假设相反。总之，我们的发现提供了腹泻病毒感染与调节Paneth细胞功能和Lgr5 ISCs命运的隐窝细胞反应之间的潜在联系，并可用于治疗应用。

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利益冲突声明

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数字

**图1。TGEV感染破坏肠道结构的完整性并破坏肠道内稳态。**
一代表性H&E染色横截面显示TGEV感染的肠道绒毛萎缩和肠细胞脱落。比例尺，100 微米。b条绒毛高度的量化(n个 = 150）和地穴深度(n个 = 150）在TGEV感染的空肠中(n个 = 3).c（c）对照组和TGEV感染仔猪空肠连接蛋白Zo-1、Occludin和Claudin-1的Western blot。肌动蛋白起控制作用。d日定量条带以证明Zo-1的蛋白质水平。**e（电子）**,**（f）**空肠横截面用KI67染色（比例尺，100 μm）和每个隐窝增殖细胞的定量(n个 = 150）和绒毛(n个 = 150）。克对照组和TGEV感染仔猪空肠的交叉切片，用Tunel染色（白色箭头显示窝中的细胞凋亡；比例尺，100 微米）。小时每个隐窝坏死细胞的定量(n个 = 150）和绒毛(n个 = 150).

**图2。TGEV感染抑制Lgr5 ISCs的自我更新和吸收谱系的分化。**
一荧光原位杂交探针*Lgr5级*和*奥尔夫姆4*在空肠上进行，显示TGEV感染降低了*Lgr5级*和*奥尔夫姆4*.b条每个隐窝Lgr5和Olfm4干细胞数量的量化(n个 = 150).c（c）Western blot检测对照组和TGEV感染仔猪空肠连接蛋白Olfm4、Muc2、SI和CgA。肌动蛋白起控制作用。d日定量条带以证明Olfm4、Muc2、SI和CgA的蛋白质水平。**e（电子）**,**（f）**荧光原位杂交探针*溶解酵素*（Paneth细胞）在空肠上进行，并对每个隐窝的Paneth电池进行量化(n个 = 150).克,小时用CgA染色的空肠横截面显示肠内分泌，并量化每个隐窝的肠内分泌(n个 = 150）和绒毛(n个 = 150).我,j个典型空肠PAS染色横截面，显示杯状细胞（黑色箭头）和每个隐窝杯状细胞的数量(n个 = 150）和绒毛(n个 = 150），（比例尺，100 μm）。

**图3。TGEV感染导致CD24⁺子系统控制器^高的细胞（Paneth细胞）丢失和Notch信号失活。**
一TGEV感染的IPEC-J2细胞中CD24的代表性FACS。b条CD24定量⁺子系统控制器^高的（Paneth细胞）和CD24⁺子系统控制器^低的TGEV感染的IPEC-J2细胞中的（肠内分泌细胞）数量。**c（c）**通过定量PCR（qPCR）分析感染TGEV的仔猪空肠中ISCs生态位信号（Notch、Wnt和EGF信号）的标记。d日TGEV感染的IPEC-J2细胞中代表性的Notch因子mRNA变化。**e（电子）**TGEV感染仔猪空肠中Notch效应器Hes5和Notch配体DII4的Western blot检测。**（f）**定量条带以证明DII4和Hes5的蛋白质水平。克在TGEV感染的IPEC-J2细胞中，通过western blot检测代表性Notch因子（DII4和Hes5）和肠上皮细胞标记物Muc2、SI、CgA和CD24。小时24天用FACS测试TGEV含量 TGEV感染IPEC-J2细胞后h，DAPT预处理12小时感染TGEV前h，在TGEV感染期间继续添加DAPT。

**图4。TGEV感染诱导CD24线粒体损伤和ROS生成⁺子系统控制器^高的细胞和CD24⁺子系统控制器^低的细胞。**
IPEC-J2细胞被TGEV感染指定时间点。一CD24细胞线粒体损伤的流式细胞术⁺子系统控制器^高的细胞和CD24⁺子系统控制器^低的细胞。b条CD24中细胞总ROS水平的FACS⁺子系统控制器^高的细胞和CD24⁺子系统控制器^低的细胞。

**图5。TGEV最初侵入CD24⁺子系统控制器^高的高表达TGEV侵袭受体APN（CD13）的细胞（Paneth cells）。**
IPEC-J2细胞在指定的时间点感染TGEV。(一,b条)用TGEV抗体染色，用流式细胞术测定TGEV感染细胞的百分率。(**c（c）**)不同细胞类型CD13（TGEV受体APN）的FACS。(d日)24小时后不同细胞类型TGEV含量的FACS TGEV感染h。

**图6。TGEV编码的NSP10和NSP16介导细胞增殖和Lgr5 ISCs命运。**
一在TGEV基因稳定的细胞系中分析细胞增殖（KI67）、CD24细胞数量和Notch信号因子DII4和Hes5。文氏图描述了通过FACS和western blot确定的细胞增殖减少的数量和CD24细胞数量以及下调的Notch信号。b条TGEV NSP稳定细胞系中KI67的FACS。**c（c）**在TGEV-NSPs稳定细胞系中通过western blot检测Notch因子和肠上皮标记物Muc2、SI、CgA和CD24。d日TGEV NSP稳定细胞系CD24的FACS。

**图7。TGEV编码的NSP10/NSP16蛋白复合物不仅与DII4相互作用，而且改变了DII4启动子的活性。**
一用空载体pLVX-AcGFP1-Flag-NSP10和pLVX-AcGFP1-Flag-NSP16稳定转染IPEC-J2细胞。用抗Flag单克隆抗体免疫沉淀细胞裂解物，然后用DII4单克隆抗体的免疫印迹来评估NSP10、NSP16和DII4蛋白之间的相互作用。b条用空载体pLVX-DsRed-Monomer-Flag-NSP10、pLVX-AcGFP1-Flag-NSP16和/或pLVX-mVenus-HA-DII4质粒转染HEK-293T细胞。细胞裂解物与抗Flag®M2抗体共同免疫沉淀，然后使用抗HA单克隆抗体对DII4进行免疫印迹，以评估NSP10、NSP16和DII4蛋白之间的相互作用。**c（c）**HEK-293T细胞与pLVX-AcGFP1-Flag-NSP10、pLVX-AcGFP1-Flag-NSP16和pLVX-mVenus-HA-DII4共转染。Duolink PLA的代表性成果。粉红色荧光表示PLA信号（比例尺，50 微米）。d日用pLVX-DsRed-Monomer-Flag-NSP10、pLVX-AcGFP1-Flag-NSP16和pLVX-mVenus-HA-DII4共同转染HEK-293T细胞。然后，将细胞固定在36 转染后h检测NSP10、NSP16和DII4蛋白的共定位（比例尺，5 微米）。**e（电子）**列出了潜在的启动子区域和潜在启动子区域的三个不同片段的信息。外显子1的起始位点被指定为+1 bp。**（f）**P1（−310）的相对荧光素酶活性 bp）。克)P2（−310）的相对荧光素酶活性 bp至-210 bp），P3（-210 bp至−110 bp）和P2（−110 bp至+1 bp）。

**图8。TGEV介导肠道稳态破坏的拟议机制模型。**
在正常情况下（上面板），Lgr5 ISCs不断生成快速增殖的TA细胞，这些细胞分化为绒毛上的各种功能细胞（肠细胞、簇状细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞），以取代绒毛尖端失巢所丢失的肠上皮细胞。Paneth细胞不常见，因为它们与Lgr5 ISCs结合，并为Lgr5 ISCs的命运决定提供生态位因子（如Notch信号），这对肠上皮细胞更新和肠内稳态维持至关重要。TGEV感染后（下表），TGEV通过APN受体靶向Paneth细胞进行初始侵袭，并强烈诱导Paneth电池中的细胞凋亡，导致Lgr5 ISCs自我更新和分化的Paneth数量和生态位因子（Notch信号）急剧减少。Notch信号传导是分泌谱系和吸收谱系分化之间的转换，在肠细胞命运决定中起着至关重要的作用。Notch信号抑制以吸收性肠细胞为代价诱导杯状细胞分化。有趣的是，杯状细胞分泌的粘液含有唾液酸，可促进TGEV感染。因此，随着时间的推移，TGEV侵入肠上皮细胞越多，体内发生的损伤就越严重。TGEV感染的空肠逐渐形成恶性循环。这完美地解释了为什么TGEV感染的空肠会出现尖锐绒毛萎缩。整个过程由TGEV编码的NSP10和NSP16介导，它们相互作用调节Lgr5-ISCs的命运和肠道稳态。

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1. van Es JH等，Dll1+分泌性祖细胞在隐窝损伤后恢复为干细胞。自然细胞生物学。2012;14:1099–1104. doi:10.1038/ncb2581。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[5] Rathinam VAK，Chan FK。炎症、炎症和组织稳态。2018年摩尔医学趋势；24:304–318. doi:10.1016/j.molmed.2018.01.004。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Rathinam VAK，Chan FK。炎症、炎症和组织稳态。2018年摩尔医学趋势；24:304–318. doi:10.1016/j.molmed.2018.01.004。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Nusse YM等。寄生蠕虫在肠道干细胞生态位中诱导胎儿样逆转。自然。2018;559:109–113. doi:10.1038/s41586-018-0257-1。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Nusse YM等。寄生蠕虫在肠道干细胞生态位中诱导胎儿样逆转。自然。2018;559:109–113. doi:10.1038/s41586-018-0257-1。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[9] van Es JH等，Dll1+分泌性祖细胞在隐窝损伤后恢复为干细胞。自然细胞生物学。2012;14:1099–1104. doi:10.1038/ncb2581。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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