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.2020年1月17日；11(1):370.
doi:10.1038/s41467-019-14025-0。

Rad50锌钩作为可与SMC铰链互换的本构二聚模块发挥作用

Hisashi Tatebe公司 1, Chew Theng Lim公司 1, Hiroki Konno公司 2, Kazuhiro Shiozaki先生 1 3, 阿基拉·希诺哈拉 4, Takayuki Uchihashi公司 5 6, Asako Furukohri公司 7
附属公司

Rad50锌钩作为可与SMC铰链互换的本构二聚模块发挥作用

Hisashi Tatebe公司等。 国家公社. .

摘要

人类Mre11/Rad50复合体是基因组维持途径中的关键因素之一。先前的原子力显微镜（AFM）纳米级成像显示，人类Mre11/Rad50复合物的环状结构在Rad50的锌钩处瞬时打开。然而，通过高速AFM对人类Mre11/Rad50复合体的成像显示，Rad50线圈臂始终由二聚体挂钩桥接，而Mre11/Rad50环通过断开头部结构域打开；类似于其他SMC蛋白，如凝集素或凝集素。这些结构特征在酵母和细菌Mre11/Rad50复合物中保存。含有嵌合Mre11/Rad50复合物的酵母菌株含有细菌凝集素MukB的SMC铰链，而不是Rad50挂钩，能够在DNA修复中正常发挥作用。我们认为Rad50挂钩的基本作用类似于SMC铰链，它是相当稳定的二聚化界面。

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数字

图1
图1。高速AFM捕捉缓冲液中人Mre11/Rad50/Nbs1复合物的动态结构。
一Mre11/Rad50复合体及其具有五种不同结构（深绿色卡通）的简化版本的示意图。图中示意性地描述了当戒指成为头饰时手臂可能的运动。b条ATP-γ-S存在下人类MRN的一种柔性环形结构。序列图像显示线圈臂的运动。成像速度：130 毫秒/帧。“H”：吊钩。c（c）云母上MRN分子的景观图像（−ATP）。MRN分子的假定结构被描绘在图像周围。d日MRN在存在ATP-γ-S的情况下形成环（左）和顶盖（右）结构。“H”：钩。e（电子）在ATP的存在下，可以看到栓在头部的小球分子。中间图像的假定结构被描绘在图像旁边。成像速度：150 毫秒/帧。（f）野生型和突变型Rad50的氨基酸序列（681-691 a.a.）。在Rad50中CC/GG公司，两个保守的半胱氨酸残基被甘氨酸取代（显示为红色字体）。序列图像显示，钩缺失突变株Mre11/Rad50（MRCC/GG公司)（−ATP）。成像速度：600 毫秒/帧。
图2
图2。人类Mre11/Rad50的结构变化及其通过高速AFM成像的交换视频。
一包含人类Mre11/Rad50环形和头开结构的景观图像（左：−ATP；右：+ATP）。Mre11/Rad50分子的假定结构用图像周围的深绿色线描绘。b条人类Rad50（−ATP）的景观图像。c（c）观察到人类Mre11/Rad50（−ATP）的代表性环状结构。假定结构的示意图如下所示。在（i）和（iii）中，其中一条手臂（蓝线）似乎在特定位置翻转并扭曲了180度（黑色椭圆形）。d日人类Mre11/Rad50的运动通过直接向成像室中添加蛋白质实时成像，同时在100时成像 毫秒/帧（+ATP）。扫描大小，100 × 100 纳米。上部：打开戒指的Mre11/Rad50序列图像。中部：关闭戒指的相同Mre11/Lad50。下部：从电影中选择的显示戒指和闭合/臂平行结构的图像。
图3
图3。S.pombe公司Mre11/Rad50和大肠杆菌Mre11/Rad50（SbcCD）在结构上与人类Mre11/Rad50相似。
一（i） 环和（ii）的开放/臂连接结构S.pombe公司Mre11/Rad50（−ATP）。“H”：吊钩。b条显示线圈线圈臂运动的序列图像S.pombe公司Mre11/Rad50。成像速度：每帧500毫秒。c（c）观察到的各种结构大肠杆菌SbcCD（−ATP）。（i） 开放式/臂连接式，（ii）头开式，（iii）环形，和（iv）“S”型结构。d日扫描时将蛋白质添加到成像室，实时成像SbcCD（−ATP）。显示了结构瞬态。成像速度：每帧150毫秒。扫描大小，100 × 100 纳米。从单个SbcCD分子电影（补充电影7）中选取的代表性图像显示了假定结构的示意图。
图4
图4。嵌合体Mre11/Rad50含有MukB SMC铰链而非Rad50锌钩，在体内有效修复DNA损伤。
一左：结构比较暴躁P.furiosusRad50锌钩（上部；PDB 1L8D）和大肠杆菌MukB铰链（下部；PDB 2WMM）。品红色和灰色显示的区域在S.pombe公司Rad50锌钩和大肠杆菌MukB铰链。锌钩结构中的N端和C端线圈区域分别为青色和黄色。右：（i）S.pombe公司Mre11/Rad50-MukBhinge（−ATP）。（ii）显示Mre11/Rad50-MukBhinge打开头部的代表性图像。成像速度：500 毫秒/帧。b条裂变酵母rad50-MukBhinge公司细胞没有表现出细胞伸长表型。A类拉德50+应变，应变(雷达50+：PA，HT1697），arad50-MukBhinge公司应变，应变(rad50-MukBhinge:宾夕法尼亚州，HT1683），以及拉德50缺失菌株(∆rad50，HT1250）在YES中生长，然后用DIC显微镜观察。比例尺：5 微米。c（c）Rad52焦距不增加rad50-MukBhinge公司细胞。在以下携带雷达52+：YFP等位基因：拉德50+(拉德50+：PA，HT1792），rad50-MukBhinge公司(rad50-MukBhinge:宾夕法尼亚州，HT1791）和∆雷达50(∆rad50，HT1790）。给出了叠加在亮场显微图像上的Rad52-YFP投影图像。比例尺：5 微米。d日裂变酵母rad50-MukBhinge公司菌株和野生型菌株在基因毒素的存在下生长。在以下菌株中检测了对CPT和HU的敏感性：未标记的拉德50+野生型菌株（KS1598），两个PA-epitope标记拉德50+菌株（HT1633、HT1697），两个PA-epitope标记rad50-MukBhinge公司菌株（HT1655、HT1683）和∆rad50缺失菌株（HT1250）。e（电子）γH2A水平在携带rad50-MukBhinge公司使用以下基因型的菌株通过免疫印迹法检测γH2A水平：放射性核素3+ 拉德50+（KS1598），∆rad3 rad50+（32725财年），∆rad3 rad50+：PA（HT1770），∆rad3 rad50-MukBhinge:PA（HT1768），以及∆rad3∆rad 50（HT1782）。源数据作为源数据文件提供。（f） rad50-MukBhinge公司纯合子孢子状，无明显缺陷。在以下配对类型相反的菌株之间诱导交配、减数分裂和孢子形成：拉德50+：PA（HT1693、HT1697），rad50-MukBhinge:宾夕法尼亚州（HT1680、HT1683），以及∆rad50（HT1250，HT1257）。DIC显微镜下观察到孢子形成。比例尺：5 微米。
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