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.2020年1月16日；10(1):439.
doi:10.1038/s41598-019-57360-4。

Flavanomarein通过靶向脾酪氨酸激酶抑制HK-2细胞高葡萄糖刺激的上皮-间质转化

张楠楠 1 2, 金森康 2, 刘帅帅 三, 斯蒙古 三, 宋志鹏 1 2, 李凤祥 2, 王丽凤 4, 蓝瑶 5, 田莉 6, 李林林 2, 叶旺（Ye Wang） 2, 李学军 # 7, 毛新民 # 8 9
附属公司

黄曲霉毒素通过靶向脾脏酪氨酸激酶抑制高糖刺激的HK-2细胞上皮间充质转化

张楠楠等。 科学代表. .

摘要

Flavanomarein（FM）是金鸡菊的主要天然化合物，对糖尿病肾病（DN）具有保护作用。在本研究中，我们研究了FM对高糖（HG）刺激的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）中上皮-间充质转化（EMT）的影响及其潜在机制，包括直接靶点和下游信号相关蛋白。通过western blot评估FM对EMT标记蛋白的影响。使用Discovery Studio 2017 R2搜索FM的潜在靶蛋白。基因本体（GO）分析用于丰富生物过程中蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中的蛋白质。通过分子动力学和表面等离子体共振分析（SPR）检测FM与靶蛋白的特异性结合。FM通过Syk/TGF-β1/Smad信号通路促进HG刺激的HK-2细胞增殖并抑制EMT。脾酪氨酸激酶（Syk）被预测为最可能与FM直接相互作用的蛋白。Syk抑制剂和FM联合治疗DN具有巨大潜力，是一种有效的新型治疗策略。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
FM对HK-2细胞活力和细胞形态的影响（MTS分析）。(一,b条)FM对HK-2细胞活性的影响。(c（c）)FM对HG刺激48小时HK-2细胞活力的影响 小时(d日)FM对HG刺激48小时HK-2细胞形态的影响 小时（50×）。黑色箭头表示经历过EMT的细胞。数据以平均值表示 ± SD中，n个 = 3（三个单独的实验）。*P（P）<0.05,**P（P）<0.01,***P（P）<与对照组和##P（P）<0.01,###P（P）<0.001，与HG（HG，高糖；FM，黄烷马林）相比。
图2
图2
FM抑制HG处理的HK-2细胞中α-SMA、FN和Vimentin的表达，同时增强E-cadherin的表达。(一)E-cadherin、α-SMA、Vimentin和FN的Western blot分析。(b条–e（电子）)E-cadherin、α-SMA、Vimentin和FN的western blot数据的统计分析。数据以平均值表示 ± 标准偏差，n = 3（三个单独的实验）。*P（P）<0.05,**P（P）<0.01,***P（P）<0.001，与对照组相比，以及#P（P）<0.05,##P（P）<0.01,###P（P）<0.001，与HG（HG，高糖；FM，黄烷马林）相比。
图3
图3
鉴定FM对细胞迁移影响的关键蛋白。(一)反向靶点筛选衍生的蛋白质相互作用（PPI）网络。PPI网络由1254个节点和1463条边组成，粉红色节点代表15种人类种子蛋白。(b条)在PPI网络上进行基因本体（GO）分析，根据节点的“生物过程”注释来丰富节点。描述了与细胞运动相关的GO和根项的结构。GO项的颜色表示p值，大小表示富集蛋白质的数量。
图4
图4
Syk和FM的蛋白质-糖相互作用、分子动力学和结合亲和力分析(一)Syk和FM在最佳对接姿势下的交互模型。-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY得分为-75.1069 千卡/摩尔(b条)Syk和配体LASW836在最佳对接姿势下的相互作用模型。-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY评分为−57.4404 千卡/摩尔(c（c）)Syk和FM在最佳对接姿势下的详细交互模式。(d日)溶剂中Syk-FM络合物的模型。(e（电子）)药物位置RMSD。(（f）)Syk中Lys458氨基酸残基中FM的O与HN之间的距离。(克)Syk和FM之间氨基酸残基的势能(小时)使用分子动力学评估Syk和FM之间氨基酸残基的相互作用能。(我)使用Biacore T200实时测量FM结合亲和力。从注射不同浓度的FM（6.25、12.5、25、50、100和200）获得的代表性传感器图 微米；曲线从下到上）。注：FM显示在杆表示中，而Syk的残留物显示为球。水被描绘成粉红色。
图5
图5
Syk抑制剂BAY61-3606抑制α-SMA、波形蛋白和FN的表达，并增强E-cadherin的表达。(一)E-cadherin、α-SMA、Vimentin和FN的Western blot分析。(b条–e（电子）)E-cadherin、α-SMA、Vimentin和FN的western blot的统计分析。数据以平均值表示 ± 标准偏差，n = 3（三个单独的实验）。*P（P）<0.05,**P（P）<0.01,***P（P）<0.001，与对照组和#P（P）<0.05,##P（P）<0.01,###P（P）<0.001，与HG相比（注：80 微米FM；1 µM BAY61-3606；HG，高糖；FM，黄烷霉素）。
图6
图6
Syk抑制剂通过抑制Syk/TGF-β1/Smad信号通路改善EMT。(一)对HK-2细胞中p-Syk/Syk、TGF-β1、Smad4、p-Smad2/Smad2表达的蛋白质印迹分析。(b条–e（电子）)HK-2细胞中p-Syk/Syk、TGF-β1、Smad4、p-Smad2/Smad2的western blots统计分析。数据以平均值表示 ± 标准偏差，n = 3（三个单独的实验）。*P（P）<0.05,**P（P）<0.01，与对照组和#P（P）<0.05,##P（P）<0.01,###P（P）<0.001，与HG相比（注：80 微米FM；1 µM BAY61-3606；HG，高糖；FM、黄曲霉素）。
图7
图7
Syk siRNA通过抑制Syk/TGF-β1/Smad信号通路改善肾脏EMT。(一)Syk siRNA的基因沉默效应(b条)HK-2细胞中TGF-β1、Smad、p-Smad2和Smad4的Western blot分析。(c（c）–（f）)HK-2细胞TGF-β1、p-Smad2和Smad4蛋白印迹数据的统计分析。数据以平均值表示 ± 标准偏差，n = 3（三个单独的实验）。*P（P）<0.05,**P（P）<0.01,***P（P）<0.001，与对照组相比，以及#P（P）<0.05,###P（P）<0.001，与对照siRNA（对照siRNA，负干扰对照siRNA）相比。
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