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.2020年1月10日；9(1):182.
doi:10.3390/细胞9010182。

LRP1介导的AggLDL内吞促进HL-1细胞中胆固醇酯的积累并影响胰岛素反应

弗吉尼亚Actis Dato 1 2, 阿莱达·贝尼特斯·阿马罗 三 4, 大卫·德·冈萨洛·卡尔沃 三 4 5, 马克西米利亚诺·巴斯克斯 1 2, 古斯塔沃·博纳奇 1 2, 维森塔·洛伦特·科尔特斯 三 4 5, 古斯塔沃·阿尔贝托·齐亚布兰多 1 2
附属机构

LRP1介导的AggLDL内吞促进HL-1细胞胆固醇酯积累并损害胰岛素反应

弗吉尼亚州Actis Dato等。 细胞. .

摘要

A类摘要：代谢综合征和2型糖尿病期间频繁发生的心血管疾病（CVD）与聚集型小LDL颗粒水平增加有关。聚集低密度脂蛋白（aggLDL）内化由促进细胞内胆固醇酯（CE）积累的低密度脂素受体相关蛋白-1（LRP1）介导。此外，LRP1在调节胰岛素受体（IR）和葡萄糖转运蛋白4型（GLUT4）活性中起着关键作用。然而，以前还没有在心肌细胞中研究LRP1、CE积累和胰岛素反应之间的联系。我们旨在确定aggLDL通过与LRP1的相互作用产生CE积累并影响HL-1细胞中胰岛素诱导的细胞内信号和GLUT4转运的机制。我们证明LRP1介导aggLDL的内吞作用并促进CE在这些细胞中的积累。此外，aggLDL降低了IR和LRP1之间的分子关联，并削弱了胰岛素诱导的细胞内信号激活。最后，aggLDL影响胰岛素刺激细胞中GLUT4向质膜的易位和2-NBDG的摄取。我们得出结论，LRP1是胰岛素反应的关键调节因子，通过LRP1介导的aggLDL内吞作用，CE积累可以改变胰岛素反应。

关键词：葡萄糖；细胞内交通；脂质；膜；发送信号。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
HL-1细胞的细胞内脂质含量和aggLDL摄取。(A类)用100µg/mL aggLDL孵育HL-1细胞8 h后，对其脂质提取物进行薄层色谱分析。谱带对应于细胞内胆固醇酯（CE）、甘油三酯（TG）和游离胆固醇（FC）。右侧面板显示了通过复制分析的标准的CE/TG/FC波段。(B类)条形图表示与CE相对应的各条件下FC含量的波段光密度的平均值±SEM。通过Student’st吨-独立样本测试。（***）表示显著差异(第页<0.0001）与对照组相比。进行了三个独立的实验。(C类)用共焦显微镜观察预孵育或未孵育400 nM GST-RAP的HL-1细胞，然后用100µg/mL aggLDL-DiI处理8 h。观察到aggLDL-DiI的荧光发射，红色和黄色虚线代表细胞形状。细胞核用Hoechst标记。比例尺对应于10µm。(D类)条形图表示每个细胞面积Dil荧光强度的平均值±SEM。（*）表示显著差异(第页<0.05）。重复进行三个独立实验，每个实验分析20个细胞。
图2
图2
LRP1在HL-1细胞中的细胞内分布和表达水平。(A类)在没有或存在100µg/mL aggLDL-Dil的情况下培养HL-1细胞8小时的共焦显微镜显示绿色的LRP1和红色的aggLDL-DiI。插图：虚线中框架区域的放大倍数为4倍。MASK表示二进制图像，其中LRP1和aggLDL之间的共同定位像素以白色显示。相应的定量分析显示为共定位百分比的平均值±SD。这些图像代表了每种情况下30个细胞，来自三个独立的实验。比例尺对应10μm。(B类)用100µg/mL的aggLDL-DiI孵育HL-1细胞8小时后的共焦显微镜显示LRP1和aggLDL-Dil与早期内体标记物[EEA1]之间的三重共定位分析+]. 插图表示虚线中框架区域的4倍放大倍数。白色箭头表示包含三个共定位扇区的囊泡。这些图像代表了每种情况下30个细胞，来自三个独立的实验。比例尺对应10μm。(C类)条形图表示LRP1、aggLDL-Dil和不同细胞间隔间标记物（EEA1、Rab4、Rab11和TGN46）之间三重共定位百分比的平均值±SEM，这是从每种条件下30个细胞的定量中获得的。(D类)定量RT-PCR分析以评估暴露于100μg/mL aggLDL 8 h的HL-1细胞中LRP1 mRNA的表达。条形图显示了mRNA水平的平均值±SEM。肌动蛋白转录物的RT-PCR产物用作负荷对照。(E类)免疫印迹法检测用100μg/mL aggLDL处理8小时的HL-1细胞中LRP1β亚基。β-肌动蛋白的免疫检测用作蛋白质负载对照。条形图表示标准化为β-肌动蛋白的LRP1带的相对强度，并报告为三次不同实验中对照组的倍数变化。
图3
图3
经aggLDL处理的HL-1细胞中IR和LRP1之间的分子关联。(A类)免疫沉淀法测定IR。用抗IR抗体免疫沉淀细胞裂解物，然后进行SDS-PAGE，然后进行LRP1和总IR的Western blot分析。用100µg/mL的aggLDL孵育或不用100 nM的胰岛素孵育细胞8小时，然后用100 nM-胰岛素刺激或不刺激细胞30分钟。第1道，免疫球蛋白同型对照（IC）。Western blot的下面板显示了总细胞裂解物中LRP1、IR和β-肌动蛋白的检测结果。(B类)条形图表示在Western blot中获得的条带的密度定量。数值表示为LRP1条带相对于IR的相对强度的平均值±SEM，并显示为相对于对照（白条）的折叠变化。（***）表示显著差异(第页<0.0001）与对照组相比。三个独立实验重复进行。(C类)免疫沉淀法检测IR，然后免疫印迹法检测LRP1β亚单位。细胞是否与400 nM GST-RAP预孵育30分钟，然后与100µg/mL aggLDL在400 nM GST-RAP存在下孵育8小时，随后与100 nM胰岛素刺激或不刺激30分钟。第1通道，免疫球蛋白同种型对照（IC）。Western blot的下面板显示了总细胞裂解物中LRP1和β-肌动蛋白的检测结果。(D类)条形图表示在Western blot中获得的条带的密度定量。这些值表示为LRP1条带相对于IR的相对强度的平均值±SEM，并报告为相对于相应对照（白条）的折叠变化。(*) (第页<0.05）和（**）(第页<0.01）表明与对照组相比存在显著差异。重复进行三个独立实验。
图4
图4
PM中LRP1和IR蛋白水平以及胰岛素诱导的HL-1细胞内信号激活。(A类)表面LRP1和IR蛋白的生物素化分析。用100µg/mL aggLDL培养细胞8小时，然后用100 nM胰岛素刺激30分钟。通过链霉亲和素结合珠下拉从蛋白质提取物中分离生物素化蛋白。Western blot的下面板显示在总裂解物中检测到LRP1和IR，其中20%的总蛋白含量被加载到珠培养中。生物素-ATP1A1和β-肌动蛋白分别用作PM和总蛋白提取物的蛋白质负荷控制。(B类)条形图显示了与细胞表面LRP1和IR相对应的条带的相对光密度（O.D.）的平均值±SEM（称为生物素ATP1A1，作为PM蛋白的负载控制），表示为相对于对照的折叠变化（白色条）。(***) (第页<0.001）和（**）(第页<0.01）表示与对照组相比存在显著差异。以一式三份的方式进行三个独立实验。(C类)Western blot分析磷酸化IR（p-IR）、Akt（p-Akt）和AS160（p-AS160）相对于用上述aggLDL处理的HL-1细胞中每个总蛋白的含量，并用100 nM胰岛素刺激或不刺激5分钟至30分钟。β-肌动蛋白的免疫检测用作蛋白质负荷对照。(D类)条形图表示在Western blot结果中获得的条带的密度定量。相应值表示为p-IR/IR、p-Akt/t-Akt或p-AS160/t-AS160相对强度的平均值±SEM，表示为相对于对照组（白条）的折叠变化。(***) (第页<0.001）表示对照组显著增加。（编号）(第页<0.05）和（##）(第页<0.01）表示所指示的条件之间的显著差异。重复进行三个独立实验。(E类)Western blot检测HL-1细胞中磷酸化Akt（p-Akt）和总Akt。(F类)条形图表示条带的密度定量。数值表示为p-Akt/t-Akt相对强度的平均值±SEM，报告为相对于相应控制（车道1和车道5）的变化倍数。(**) (第页<0.01）和（***）(第页<0.0001）表明与经或不经aggLDL处理的细胞以及经或不经过GST-RAP处理的细胞之间存在显著差异。重复进行三个独立实验。
图5
图5
血浆中GLUT4蛋白的水平和经aggLDL和胰岛素处理的HL-1细胞对2-NBDG的摄取。(A类)用100µg/mL的aggLDL孵育8小时，然后用100 nM的胰岛素刺激30分钟后，从蛋白质提取物中进行表面蛋白质的生物素化分析，以检测生物素化GLUT4。然后，用链霉亲和素结合珠孵育分离细胞表面的生物素蛋白。Western blot的下面板显示了在总细胞裂解物中检测到的GLUT4。ATP1A1和β-肌动蛋白分别用作蛋白质负荷对照。(B类)条形图表示不同条件下细胞表面GLUT4对应条带的相对光密度（O.D.）的平均值±SEM（称为生物素ATP1A1，作为PM蛋白的负载控制），表示为相对于对照（白色条）的折叠变化。(*) (第页<0.05）表明与对照组相比存在显著差异。以一式三份的方式进行三个独立实验。(C类)共聚焦显微镜观察HL-1细胞与80μM 2-NBDG（绿色）是否与100µg/mL aggLDL孵育8 h，并与100 nM胰岛素刺激或不刺激30 min。这些图像代表了三个独立实验中每个条件下的20个细胞。比例尺对应10μm。虚线表示单元格形状。(D类)条形图表示每个细胞面积2-NBDG荧光强度的平均值±SEM，表示为对照组的折叠几率（白色条）。(***) (第页<0.001）表明与对照组相比存在显著差异。(###) (第页<0.001）表示指示条件之间存在显著差异。(E类)用400 nM GST-RAP预孵育HL-1细胞，并用100µg/mL aggLDL处理或不处理8小时，共聚焦显微镜观察。然后，用100 nM胰岛素和80μM 2-NBDG（绿色）刺激或不刺激细胞30分钟。图像代表每种情况下的20个细胞。比例尺对应20μm。虚线表示单元格形状。(F类)条形图表示每个细胞面积2-NBDG荧光强度的平均值±SEM，表示为对照组的折叠变化（白色条）。(***) (第页<0.0001）表示与对照组相比存在显著差异。进行了三个独立的实验，一式两份。
图6
图6
LRP1介导HL-1细胞聚集LDL摄取和胰岛素反应受损。LRP1介导aggLDL的结合和内吞作用（表示为(一)导致细胞内胆固醇酯（CE）积聚。在本研究中，我们证明LRP1/aggLDL复合物主要位于早期内体[EEA1+]中，这可能导致LRP1胰岛素依赖性分布从网格蛋白域到脂筏/小窝域（表示为b条). 此外，我们发现，aggLDL的积累也改变了LRP1和IR之间的分子关联，这可能导致胰岛素反应受损，其特征是（1）改变胰岛素诱导的细胞内信号激活，（2）减少GLUT4对PM的流量，以及（3）减少葡萄糖摄取。EE，早期内体；GLUT4，葡萄糖转运蛋白4；GSV、GLUT4储存囊泡。
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