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.2020年1月23日;180(2):323-339.e19。
doi:10.1016/j.cell.2019.12.014。 Epub 2020年1月9日。

迁移神经元排斥诱导中Teneurin-Latrophilin相互作用的结构基础

附属公司

迁移神经元排斥诱导中Teneurin-Latrophilin相互作用的结构基础

丹尼尔·德尔·托罗等。 单元格. .

摘要

肌腱蛋白是古老的后生动物细胞粘附受体,控制高等动物的大脑发育和神经元连接。细胞外C末端结合粘附性GPCR Latrophilin,形成具有突触功能的跨细胞复合物。然而,Teneurins、Latrophilins和FLRT蛋白也在小鼠早期发育阶段的皮层细胞迁移过程中表达。在这里,我们展示了Teneurin-Latrophilin复合物的晶体结构,揭示了Latrophillin的凝集素和嗅球蛋白结构域如何与Teneurin的螺旋β-桶结构域YD壳结合。我们将基于结构的蛋白质工程与生物物理分析、细胞迁移分析和宫内电穿孔实验相结合,以探讨相互作用在皮层神经元迁移中的重要性。我们发现Lattrophilins与Teneurins和FLRT的结合利用接触排斥依赖机制指导神经元的迁移。这种效应是在细胞体和小神经突上观察到的,而不是在它们的突起上。结果表明,结构编码的突触蛋白复合物也可用于排斥性细胞导向。

关键词:FLRT;拉托菲林;Teneurin;粘附;皮层发育;神经元迁移;锥体神经元;放射状胶质细胞;排斥。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

无
图形摘要
图1
图1
Teneurin-Latrophilin复合物的晶体结构(A)Teneurin、Latrophillin和FLRT域结构示意图。抗生素结合域;表皮生长因子结构域;纤维连接蛋白结构域;FN插头,纤维连接蛋白插头结构域;GAIN,GPCR自蛋白水解诱导结构域;荷尔蒙,荷尔蒙结构域;ICD,胞内结构域;Lec,凝集素结构域;LRR,富含亮氨酸重复序列;NHL、NCL-1、HT2A和Lin-41域;嗅觉,嗅觉素结构域;7TM,七-TM域;TTR;转甲状腺素样结构域;TM,跨膜螺旋;YD外壳,酪氨酸天冬氨酸重复。(B) 鸡Ten2与小鼠Lphn2-Lec复合物C末端结构域的晶体结构。颜色如(A)所示。显示N和C端子。NHL域中交替拼接环的位置(Berns等人,2018)以绿色表示为球体。(C) 鸡Ten2的C末端结构域与小鼠Lphn1-Lec-Olf结构域复合物的晶体结构。FLRT LRR域(Jackson等人,2016)通过对齐两个结构的Olf域而重叠。(D) (B)中结构的俯视图。(E) (C)中结构的俯视图。(F) 50-ns约束模拟期间氢键分析总结。图中显示了在两种蛋白质之间形成稳定氢键的原子,而彩色块则表明了模拟过程中氢键的稳定性。(G) Lphn-Lec和Teneurin YD壳之间的结合界面包括两个主要的相互作用区域(方框区域)。选定的氢键残留物显示为棒状物。氢键显示为黄色线条。相互作用的残基根据(G)中的方案着色。(H和I)如(G)、顶部(H)和底部(I)所示的两个主要绑定区域的放大视图。
图S1
图S1
Teneurin-Latrophilin复合物的晶体结构,与图1(A)相关。Ten2与Lphn1-Lec-Olf复合物中的模型以洋红色显示,模型聚糖以黄色显示。从精细模型计算出了体溶剂校正的2Fo-Fc电子密度图,并以蓝色(1σ-水平)显示,在模型周围10º的半径范围内。(B) 如面板A所示,但显示了Ten2-Lphn2-Lec复合体及其2FoFc地图的一份副本。(C) Ten2与Lphn2 Lec(黑带)和Lphn1 Lec-Olf(白带)复合物的叠加。Ten2以表面视图显示,颜色为蓝色(TTR、FN-plug、NHL、YD-shell)和红色(内部连接体、ABD和Tox-GHH域)。在相关复合物结构中与Lphn1-Lec-Olf接触的Teneurin残基以黄色突出显示。(D) FLRT2 LRR结构域的叠加,如前所述,当绑定到Lphn3 Olf结构域时(Jackson et al.,2016)产生了所示的三元络合物模型。(E) 与Lphn1-Lec-Olf(黄丝带)复合物中的Ten2表面模型显示了基于序列守恒的Consurf(Glaser等人,2003)计算的守恒分数。保护程度用颜色表示;蓝色=高度保守,白色=不保守。(F) 如面板E所示,但将Lphn1(表面表示)和Ten2的计算表面守恒显示为带状(N端:深蓝色,C端:红色)。(G) 500-ns(ns)模拟揭示了域相对于YD壳的灵活运动。均方根偏差(RMSD)值随时间绘制。Linker/ABD/Tox-GHH(2467-2797),YD-shell(1602-2466)。NHL(237-1601),FN-plug(1047-1236)。(H,I)在晶体结构中发现的Ten2和Lphn2-Lec络合物的表面视图。在50 ns受限模拟中,有助于形成稳定氢键的残留物以红色阴影突出显示(见图1F)。(J) 对Ten2-Lphn2-Lec结构域复合体进行500 ns无约束MD模拟期间的氢键分析进行了总结。选择的颜色与模拟期间键的稳定性相关,范围从红色(=稳定)到白色(=不稳定)。来自500 ns无限制模拟的相互作用残基映射到Lphn2-Lec域(K)和Ten2-YD-shell(L)表面。
图2
图2
突变体十书信电报和LphnTL公司破坏Teneurin-Latrophilin结合(A–C)研究中使用的Teneurin(Ten;A)、Latrophillin(Lphn;B)和FLRT(C)结构。(D) 我们通过在HEK293细胞表面表达mVenus标记的小鼠Lphn1或鸡Ten2(绿色)来检测受体结合,并通过免疫荧光检测His标记蛋白外结构域(洋红)的结合。DAPI标记细胞核(青色)。显示了具有代表性的图像。(E和F)基于细胞的结合分析的量化结果,以测试表面表达的Ten与可溶性Lphn(E)的结合,以及表面表达的Lphn与可溶性Ten(F)的结合。n=12,∗∗∗∗p<0.0001,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(G) 在SPR实验中,我们将220个野生型或突变型小鼠Lphn1(Lec-Olf)响应单元固定在分离的流动细胞上,并使用2倍稀释系列(最高浓度2.3μM)注射Ten2蛋白。Teneurin LT和Latrophilin TL突变体不显示结合。(H) K-562细胞聚集分析表明,野生型而非突变型促进了Latrophilin表达和Teneurin表达细胞参与反式.FLRT仍与Lphn互动TL公司(I)细胞聚集试验的定量结果。n=3;∗∗∗p<0.001,∗∗∗∗p<0.0001,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(J) 在SPR实验中,我们将440个FLRT1(ecto)反应单位固定在单独的流动细胞上,并在每个实验中使用相同的浓度系列(最高浓度660 nM)注射鸡Teneurin和鼠Latrophilin分析物。在FLRT1上同时注射Teneurin和Lattrophilin可增强反应。这些结果表明,三元Teneurin-Lphn-FLRT复合物形成在体外使用FLRT2和FLRT3的结果如图S2所示。(K) 我们测试了His-tagged Lphn1(绿色)和Ten2(品红色)外结构域与表达FLRT3(白色)的HEK293细胞的结合。只有野生型Lphn1,而不是FL突变体,在细胞表面与FLRT和Teneurin形成三元复合物。(五十) 概述野生型和突变蛋白结合能力的图表。比例尺代表50μm(D和I)和20μm(K)。
图S2
图S2
Teneurin、Latrophilin和FLRT相互作用研究,与图2(A)相关。Teneurin和Latrophillin构建物分别在HEK293细胞中表达,细胞内mVenus和细胞外HA或Myc标记。我们用抗HA或抗Myc染色观察固定的非渗透性细胞的细胞表面表达。染色显示,本研究中使用的结构均在细胞表面成功表达。比例尺=150μm。(B) 我们测试了Lphn1(Lec-Olf)野生型、单突变体或双突变体蛋白与抗-His和抗鼠Alexa-594(红色)聚集在一起,与表达Ten2(绿色)的HEK293细胞的结合。Lphn1和非FLRT结合(FL)突变体与Ten2结合。非Teneurin结合(TL)突变体不结合。(C-E)SPR响应曲线如图所示。响应单位(y轴)与时间(秒)(x轴)相对应。(C) 我们将700个小鼠Lphn1(ecto)、Lphn2(exto)或Lphn3(ecto。(D,E)我们固定了FLRT2(外)或FLRT3(外)的440、300和1200个响应单元。在每个实验中,我们使用相同的浓度系列注射Teneurin和Lphn蛋白(最高浓度=660 nM)。(F) 与Lphn3转染细胞或未转染对照细胞孵育后,从与FLAG-FLRT2共转染的HEK293T细胞中提取mVenus-tagged Ten2。抗-FLAG蛋白印迹显示,与未转染的对照组相比,在Lphn3表达细胞存在的情况下,FLRT2优先被拉下。显示了三个具有代表性的重复。FLRT由箭头突出显示。(G) F中所示结果的量化。6个实验的平均结果。统计显著性通过双尾不配对t检验确定,其中∗∗∗p=0.0003。错误栏显示s.e.m。
图3
图3
Teneurins和Latrophilins在皮层发育过程中表达(A)方案显示了(B)和(E)中所示的皮层区域的位置。(B)现场所有Latrophilins(品红色)的杂交(ISH)表明,Lphn1和Lphn2在E15.5的皮层中表达。DAPI核染色显示为蓝色。显示富含神经元(Ns)和心尖祖细胞(AP)的层。(C) 使用公布的单细胞RNA分析数据量化神经元和AP中Lphn1-3的表达(Kawaguchi等人,2008;GEO:GSE10881标准). n=15–20;p<0.05,∗∗∗p<0.001,双尾Student t检验。数据显示为晶须图。(D) Lphn1(红色)和Lphn2(白色)的双ISH结合Pvim(绿色)或Ctip2(绿色)的免疫染色。显示了放射状胶质细胞(RG)所在的AP层、皮质板(CP)和中间带(IZ)。(E) 肌腱蛋白(洋红)的ISH显示神经元中的表达。DAPI核染色显示为蓝色。(F) 使用公布的数据量化神经元和AP中Ten1-4的表达(Kawaguchi等人,2008;GEO:GSE10881标准). n=15–20;∗∗∗p<0.001,双尾Student t检验。数据显示为晶须图。(G) Ten2(红色)和Ten3(白色)的双ISH结合神经元标记物Ctip2(绿色)和RG细胞标记物Pvim(绿色)的免疫染色。指示了AP层、CP和IZ的位置。(H) 2天后E15.5皮层神经元上FLRT3(红色)和Ten2(绿色)的表面染色在体外用Lphn1(Lec-Olf)蛋白处理的(DIV)表明,FLRT3和Ten2在突起(标记为1的虚线矩形)和体腔(标记为2的虚线长方形)中表达,并且靠近Lphn2蛋白(右侧的高倍图像)。有关超分辨率图像的示例,请参见图S3M。(一) 用Lphn野生型(H)或FL-TL突变型(图S3K)蛋白孵育的样品定量近端Ten2和FLRT3染色(左图)。我们还量化了所有三种蛋白质的近端染色(右图)。3个实验中n>30个场。p<0.001,∗∗∗p<0.001,双尾Student t检验。(J) 显示用于下拉控制或FLRT3抗体的皮层区域位置的方案。(K) 散点图结果显示了由对照和FLRT3抗体捕获的蛋白质簇,并通过使用无标签定量(LFQ)的质谱显示。粉红色椭圆描绘了FLRT3下拉框中丰富的蛋白质。蓝色椭圆表示对照抗体富集的蛋白质。灰色椭圆显示在这两种条件下类似富集的蛋白质。对两组单独下拉菜单的结果进行平均。Western blot结果如图S3P和S3Q所示。(五十) 一个模型显示,表达Lphns、FLRT和Teneurins的迁移神经元可以在反式Latrophilins位于放射状胶质纤维或神经元上。显示了Latrophilins的Lec和Olf结构域。比例尺代表150μm(B和E)、15μm(D、G和H)和2μm(插入H)。
图S3
图S3
Teneurins、Latrophilins和FLRT在皮层发育过程中表达,与图3(A)相关,图中显示了面板B和C上显示的冠状皮层区域的位置。(B和C)所有Latrophillins(B)和Ten1,2和3(C)的ISH用洋红着色,显示了E13.5小鼠胚胎冠状切片皮层中的蛋白质表达。DAPI核染色显示为蓝色。(D) 图E和图F显示了所有Latrophilins的皮层区域位置。(E)ISH显示,Lphn1在E17.5小鼠胚胎冠状切片的皮层中表达。(F) Ten1、2和3的ISH在E17.5小鼠胚胎冠状切片皮层中显示出较高的Ten2和3表达。(G) 使用Florio等人发表的RNA图谱数据,将小鼠根尖RG细胞中的Lattrophilin和Teneurin表达水平标准化为GAPDH。(2015)(GSE65000)。与Lphn1和Ten4相比,Lphn2的表达水平较高。数据显示为晶须图。(H) 使用Kawaguchi等人发表的RNA分析数据,在神经元(N)和心尖祖细胞(AP)中表达FLRT1-3。(2008)(地理位置:GSE10881标准). 神经元(N)中FLRT mRNA水平高于心尖祖细胞(AP)。∗∗p<0.01,双尾Student t检验。数据显示为晶须图。(一) 使用神经细胞FLRT和Teneurins的RNA-Seq数据进行相关性分析,使用GEO中发布的数据:GSE10881标准Ten2表达与FLRT1和FLRT3相关,这意味着它存在于相同的神经元中,而Ten4表达与FLRT2相关。(J) 散点图显示了E14.5小鼠皮层70个单细胞的数据,显示了FLRT3和Ten2基因表达的变化。年轻神经元簇显示FLRT3和Ten2的最强表达。我们使用了之前在GEO中发布的原始数据:GSE10881标准(K)2天后E15.5皮层神经元上FLRT3(红色)和Ten2(绿色)的表面染色在体外用Lphn1处理的培养物(DIV)TL-FL(TL-FL)(Lec-Olf)蛋白在室温下放置20分钟。FLRT3和Ten2显示出一定程度的共同定位(黄色箭头)(参见量化图3I)。虚线矩形中的区域在右侧放大。(五十) Lphn1和TL-FL双突变体与皮层神经元结合的定量。双突变体蛋白与这些培养物几乎没有结合。来自3个实验的n>30个场。∗∗∗p<0.001,双尾Student t检验。(M) 2天后E15.5皮层神经元的单分子定位显微镜(SMLM)成像在体外(DIV),对表面FLRT3(红色)和表面Ten2(蓝色)进行表面染色,并在RT处用Lphn1蛋白(绿色)处理20分钟。黄色箭头表示在SMLM分辨率约30 nm内的共定位。灰色箭头表示在传统的宽场荧光中显示出共同定位的信号,但在SMLM中只显示出接近的信号。(N) 蓝色Lphn1(Lec-Olf)与表达FLRT3(绿色)的HEK293细胞结合顺式(红色)。细胞核用DAPI染色。(O) 蓝色Lphn1(Lec-Olf)与表达Ten2(绿色)的HEK293细胞结合,但不存在Lphn2顺式(红色)。细胞核用DAPI染色。(P) 面板(N)和(O)中所示数据的量化。Lphn1(Lec-Olf)结合用FLRT3(N)、Ten(O)或非转染信号的强度标准化。n>10个字段。p<0.05,∗∗p<0.01,双尾Student t检验。(Q) western blot分析小鼠皮层E15.5的对照和FLRT3下拉物。在前两个通道上,我们分别加载40μg过度表达FLRT3和Ten2的HEK细胞作为阳性对照。第三条通道有60μg皮质裂解物(CTX)输入。最后两个通道是免疫球蛋白控制(左)和FLRT3(右)从1mg CTX组织中下拉。Ten2和FLRT3蛋白带用黑色箭头表示。(R) 量化3个下拉实验(n=3)中Q中显示的数据。p<0.05,∗∗p<0.01,双尾Student t检验。比例尺=75μm(B-F),15μm(K,N,O),2μm(插入K,概览图像以m表示),500 nm(插入m)。
图4
图4
Lattrophilin与Teneurin的相互作用和FLRT减缓细胞迁移体外试验(A) 在涂布FC(对照)、Lphn1(Lec-Olf)或Lphn2的表面上退出E15.5皮层外植体的皮层神经元的时间推移分析TL-FL(TL-FL)(Lec-Olf)蛋白。根据迁移速度对神经元进行追踪(线条)和着色。(B) 平均速度频率分布。n>每种情况10部电影。p<0.05,∗∗p<0.01,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(C) 描述纳米纤维分析的图表。(D) mCherry表达神经元(红色)在涂有FC控制蛋白的纳米纤维上迁移的延时视频快照。一个黄色箭头指向细胞体。从多极形态到双极形态的转变是可见的。引导过程偶尔出现分支(放大,黑色箭头)。(E) 用β-Ⅲ-管蛋白(红色)染色的皮层神经元具有双极形态(左侧)和一个前导过程转换到相邻纤维的示例(右侧,黄色箭头)。(F) 纳米纤维上迁移神经元的延时成像轨迹(绿色)。(G) 在涂有FC、Lphn1和Lphn2的纳米纤维上生长的外植体TL-FL(TL-FL)Lec-Olf用于2 DIV。DAPI染色是基于距外植体的平均距离进行颜色编码的,表示迁移的长度(另见图S4E)。(H) (G)中所示数据的量化。n=144个外植体(每个实验36个外植物,每个条件4个实验)。请参见图S4F中的完整图像。p<0.05,∗∗p<0.01,∗∗∗p<0.001,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(一) 如(G)所示的相同外植体,使用β-II-管蛋白染色。(J) (I)中所示数据的量化。n=144个外植体(每个实验36个,每个条件4个实验),如(H)所述。比例尺表示150μm(C)、15μm(D和E)和250μm(F、G和I)。
图S4
图S4
Latrophilin与Teneurin和FLRT相互作用减缓细胞迁移体外试验,与图4(A)有关,皮层神经元从E15.5皮层外植体迁移到FC(对照)、Lphn1或Lphn2涂层表面的时间推移分析TL-FL(TL-FL)蛋白质。神经元被追踪(彩色线条)并根据单个轨迹的长度进行彩色编码。(B) 所有轨道在所有条件下的平均长度频率分布。n>每种情况10部电影。p<0.05和∗∗p<0.01,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。数据以胡须图的形式呈现。(C) 小鼠Lphn1的FC涂层表面E15.5皮层外植体迁移皮层神经元的时间推移分析佛罗里达州(Lec-Olf)或Lphn1TL公司(Lec-Olf)蛋白。神经元被追踪(彩色线条)并根据单个轨迹中的速度进行彩色编码。(D) 所有跟踪神经元在所有条件下的平均速度频率分布。n>每种情况10部电影。p<0.05和∗∗p<0.01,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。数据显示为晶须图。(E) 说明在每个实验和条件下每个条件培养的36个外植体的组织结构的方案。右侧所示的2个外植体的高倍放大显示了2天后轴突的生长和延伸(DIV)(βIII-管蛋白染色)。DAPI染色显示存在显示神经元迁移的外植体(左侧外植体,定义为显示10个以上DAPI细胞的外植物),而其他外植体仅显示轴突延伸(右侧外植体)。通过在两侧绘制一个包含DAPI细胞的矩形来量化显示迁移的外植体,基于与两侧的平均距离,外植体按照右侧的比例尺进行颜色编码。同样的定量适用于轴突的延伸。(F) 所有条件下一次实验的完整图像(对照FC、Lphn1及其突变型Lphn2佛罗里达州,Lphn1TL公司和Lphn1TL-FL(TL-FL)). 轴突延伸在任何这些条件下都不受影响,并且发生在所有外植体(βIII-管蛋白)中。相反,DAPI染色显示,只有40%–60%的外植体显示出退出细胞迁移(定义为超过10个DAPI+细胞退出外植体)。(G) 外植体细胞迁移百分比的量化如(F)所示。n=(E)中描述的每个条件下4个实验。比例尺=300μm(E和F)。
图5
图5
Latrophilin1与肌腱蛋白和FLRT的相互作用变速箱诱导排斥(A)E15.5分离的皮层神经元生长在含有FC(黑色)和Lphn1-Lec-Olf蛋白(红色)的交替条纹上。用抗β-Ⅲ-管蛋白染色神经元,以显示神经突(绿色)和细胞核(DAPI,白色)。在放大的插图中,包含Lphn的红色条纹用黄色箭头表示。(B) 量化红色条纹上DAPI+像素的百分比。n=3个不同的实验。p<0.05,∗∗p<0.01,∗∗∗p<0.001,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(C) 在交替Lphn1(红色)和Lphn2上生长的离开皮层外植体的GFP+神经元TL-FL(TL-FL)(黑色)条纹。显示了延时实验的快照。神经元更喜欢在Lphn1上迁移TL-FL(TL-FL)在这些实验中。排斥事件被定义为一个小突起和Lphn1条纹之间的接触,持续时间不到3帧。黑色箭头表示排斥事件。(D) (C)中所示数据的量化;n>30个触点。(E) E15.5皮质外植体生长在如(A)所示的条纹上,并用抗β-Ⅲ-管蛋白染色以观察轴突。(F) (E)中所示数据的量化。n=3个不同的实验。(G) 在Lphn1(红色)和Lphn2交替生长的皮层外植体上生长的GFP+轴突TL-FL(TL-FL)(黑色)条纹。显示了延时实验的快照。没有观察到偏爱黑色或红色条纹。排斥事件被定义为轴突和Lphn1条纹之间的接触,持续时间少于3帧。白色箭头表示不受Lphn1条纹排斥的生长锥。(H) (G)中所示数据的量化;n>20个触点。比例尺代表300微米(A)、200微米(C和G)和200微米(E)。
图S5
图S5
Latrophilin1与肌腱蛋白和FLRT的相互作用变速箱诱导排斥,与图5(A)相关,E15.5分离的皮层神经元生长在含有FC(黑色条纹)和野生型或突变型TL或FL小鼠Lphn1-Lec-Olf蛋白(红色条纹)的交替条纹上。神经元用抗β-II-管蛋白染色,以显示神经突(绿色)和DAPI(白色)。显示条纹上细胞核(DAPI,白色)位置的高放大率显示在底部。含有Lphn蛋白的红色条纹用黄色箭头表示。成像后,量化红色条纹上DAPI+像素的百分比,如图5B所示。(B) E15.5皮层外植体生长在与(A)相同的条纹上,结果的量化如图5F所示。白色箭头表示包含Lphn1突变蛋白的红色条纹。比例尺代表20μm(A)和200μm(B)。
图6
图6
酪氨酸蛋白与肌腱蛋白相互作用延迟神经元迁移(A)子宫内在E15.5进行电穿孔(IUE)。(B) pCAG-Ten2-IRES-GFP或pCAG-Tin2的IUE书信电报-在E18.5进行IRES-GFP并进行分析。血凝素(HA)标记的Ten2和Ten2书信电报用抗HA(品红)免疫染色证实神经元中的蛋白表达。Ten2和Ten2书信电报表达与报告基因GFP(绿色)的表达一致。(C) 宫内节育器切除后的冠状切面。CP被细分为3个单元(上、中、下),每个单元中GFP+神经元的数量被量化。(D) (C)中所示数据的量化。n=6 GFP,n=7 Ten2,n=10 Ten2书信电报电穿孔的大脑。p<0.05,∗∗p<0.01,∗∗∗p<0.001,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(E) 对于活脑切片的延时成像,在IUE后2天的E17.5进行切片。神经元从IZ迁移到CP时进行了跟踪(右侧显示了代表性的轨迹)。虚线表示IZ和CP的位置。(F)(E)中所示数据的量化。n=61 mCherry-expressing,n=38 Ten2书信电报-在3个实验中,n=40个Ten2-表达神经元。∗∗∗p<0.001,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(G) 跟踪神经元的平均速度显示为胡须图。第二阶段-但不是第二阶段书信电报-与对照神经元相比,过度表达的神经元迁移速度显著减慢。∗∗∗p<0.001,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。比例尺代表20μm(B)、100μm(C)和80μm(E)。
图S6
图S6
在表达用于宫内电穿孔(IUE)分析的质粒pCAG-Ten2-IRES-GFP和pCAG-Ten2的HEK293细胞上,进行与肌腱蛋白相互作用延迟神经元迁移,如图6(A)所示书信电报-IRES-GFP。Ten2和Ten2书信电报HA-训练与GFP表达细胞(绿色)一致,验证了正确的细胞表面表达。(B) 表达pCAG-Ten2-IRES-GFP和pCAG-Tin2的HEK293细胞书信电报-IRES-GFP与免疫聚集Lphn1蛋白(蓝色)和免疫聚集FLRT3蛋白(红色)在室温下孵育20分钟。固定细胞成像。Ten2,但不是LT突变体,与Lphn1结合,后者又与FLRT3(黄色箭头)结合。(C) 表达pCAG-Ten2-IRES-GFP和pCAG-Tin2的HEK293细胞书信电报-IRES-GFP与免疫聚集FLRT3蛋白(红色)孵育。Ten2及其突变体Ten2书信电报在缺乏Latrophilin的情况下不要结合FLRT3。(D) 在E13.5使用pCAG-IRES-GFP、pCAG-Ten2-IRES-GFF或pCAG-Ten2进行IUE后E17.5皮质的冠状切片书信电报-IRES-GFP。皮质板(CP)是基于DAPI染色(以青色勾勒的细胞核)定义的,并细分为3个区(上、中、低)。GFP公司+定位于CP内的神经元被自动识别(用绿色勾勒),并且每个箱子中的百分比被量化。(E) (D)中所示数据的量化。n=7 GFP,n=7 Ten2,n=8 Ten2书信电报电穿孔的大脑。p<0.05,∗∗p<0.01,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。比例尺代表20μm(A-C)和150μm(D)。
图7
图7
肌腱蛋白丢失延迟神经元迁移(A)E15.5时执行的IUE示意图。(B) 用含有小鼠Ten2(红色)shRNA#2的pCAG-mCherry和pCAG-miR30对神经元进行电穿孔,在E17.5处收获并作为游离培养物进行电镀,培养2个DIV,并对表面Ten2进行免疫染色(绿色)(左图)。放大后的图像显示非电穿孔神经元的细胞核(DAPI)(绿线)和mCherry+shRNA#2+神经元(红线)(右图)。(C) (B)中所示数据的量化。n>40个非电穿孔和n>13个shRNA#2。p<0.05,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(D) E18.5皮层的冠状切片,之前用pCAG-mCherry和pCAG-miR30载体编码shRNA控制(CN)、shRNA#1或shRNA#2进行电穿孔。后两种构建物以小鼠Ten2为靶点。皮质板被细分为3个箱(上、中、下),每个箱中mCherry+神经元的数量被量化。(E) (D)中所示数据的量化。n=5 CN,n=6 shRNA#1,n=5 shRNA#2电穿孔大脑。p<0.05,∗∗p<0.01,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(F) E18.5皮层的冠状切片电穿孔以单独或与野生型或TL-FL突变体Lphn1(Lec-Olf)分泌型表达mCherry。皮质板被细分为3个箱(上、中、下),每个箱中mCherry+神经元的数量被量化。(G) (F)中所示数据的量化。n=7 m樱桃,n=6 Lphn1(Lec-Olf)和n=6 L phn1TL-FL(TL-FL)电穿孔的大脑。p<0.05,∗∗p<0.01,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(H) 放射状皮层迁移中Teneurin、FLRT和Latrophilin模型的示意图。比例尺代表15μm(B)和100μm(D)。
图S7
图S7
Teneurin缺失延迟神经元迁移,与图7 A相关)HEK293T细胞与含有shRNA或对照插入物的pCAG-miR30,以及鸡Ten2(gTen2)或鼠Ten2。选择的序列仅与小鼠基因相匹配,而不是与鸡相匹配十个2。只对过度表达的小鼠Ten2观察到有效的敲除。(B) (A)中所示数据的量化。使用ImageJ量化表达,并分别使用对照gTen2或mTen2强度对gTen2-shRNA-co转染样本的值进行标准化。p=0.0168,∗∗p=0.0054,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(C) 使用pX458质粒和pCAG-mCherry,在E15.5进行IUE后用CRISPR对照、Ten2 CRISPR#1和CRISPR#2对E18.5皮层进行冠状切片。皮质板(CP)被细分为3个箱(上、中、下),每个箱中mCherry+神经元的数量被量化。(D) (C)中所示数据的量化。n=6个CN,n=5个CRISPR#1和n=4个CRISRP#2电穿孔大脑。p<0.05,采用Tukey事后分析进行单因素方差分析。(E) Western blot验证pCAGIG公司IUE实验中使用的Myc-tagged Lphn1(Lec-Olf)野生型和TL-FL突变体(图7F和7G)。该突变体包含两个额外的N-连接糖基化位点,可阻断FLRT和Teneurin结合。因此,与野生型相比,它在凝胶中的含量略高。(F) Lec-Olf构造中包含的Lphn1部分示意图(另请参见图2B)。比例尺表示150μm(C)。

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