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.2020年1月10日；11(1):213.
doi:10.1038/s41467-019-14001-8。

RNA结合蛋白HuR是脂肪生成的负调节因子

戴安娜·德志祥（Diana Teh Chee Siang） 1, 严庆林 1, 昂茂茂圭（Aung Maung Maung Kyaw） 1, Khaing Nwe Win公司 1, Sook Yoong Chia先生 1, 乌夫克·德基尔门奇 1, 向虎 2, 布莱恩·C·谭 1, 阿西纳斯·卡米尔·埃丝特·瓦莱特 1, 孙雷（Lei Sun） 三 4, 丹旭（Dan Xu） 5
附属公司

RNA结合蛋白HuR是脂肪生成的负调节因子

戴安娜·德志祥等。 国家公社. .

摘要

人类抗原R（HuR）是RNA代谢的重要调节因子，但其在代谢中的作用尚不清楚。这项研究确定HuR是脂肪生成过程中的主要阻遏物。在原代脂肪细胞培养中敲除和过度表达HuR分别增强和抑制体外脂肪生成。HuR的脂肪特异性敲除显著增强脂肪组织中的脂肪生成基因程序，并伴有全身葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。HuR基因敲除也会导致特异性表型：它可以抑制棕色脂肪中的肌生成程序，增强表皮白脂肪中的炎症程序，并诱导腹股沟白脂肪的褐变程序。从机制上讲，HuR可能通过识别和调节数百种脂肪细胞转录物的稳定性来抑制脂肪生成，包括脂肪生成过程中的负调控因子Insig1。综上所述，我们的工作将HuR确立为脂肪生成的重要转录后调节因子，并提供了RNA加工如何促进脂肪细胞发育的见解。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。HuR在体外抑制脂肪细胞分化。
一Western blot比较脂肪组织（S）和成熟脂肪细胞（M）基质血管部分中HuR的表达。b条Western blot检测原代棕色和白色脂肪细胞分化过程中HuR蛋白水平。c（c）用靶向HuR的逆转录病毒shRNAs感染原代棕色前脂肪细胞，然后诱导分化5天。实时PCR检测敲除效率（左）、BAT选择标记和泛脂肪细胞标记表达（右）。n个 = 三。d日油红O染色评估脂质积聚。e（电子）,（f）与中类似(c（c）,d日)但在原代白色脂肪细胞培养中。n个 = 4克原代棕色前脂肪细胞中HuR的逆转录病毒过度表达。在第5天进行实时PCR检测表达HuR或载体的棕色脂肪细胞培养物的HuR（左）和标记基因表达（右）。n个 = 每组4个。小时HuR-过度表达棕色脂肪细胞的油红O染色。我,j个与中类似(克,小时)但在原代白色脂肪细胞培养中。n个 = 每组4个。k人胎儿棕色脂肪细胞中HuR的逆转录病毒过度表达。实时PCR用于测定诱导后第21天HuR（左）的表达和标记基因的表达（Ctrl，n个 = 4；HuR、，n个 = 8).我诱导后第21天对人棕色脂肪细胞进行油红O染色。比例尺代表100 微米。米,n个类似于(k,我)诱导后第14天在人类皮下WAT中（Ctrl，n个 = 6; HuR、，n个 = 5). 比例尺代表100 微米。误差线为平均值 ± SEM。使用学生的统计显著性t吨-测试(克), (我), (k)、和(米)，单向方差分析测试(c（c）)和(e（电子）), *第页 < 0.05. 源数据以源数据文件的形式提供。
图2
图2。脂肪组织中HuR基因敲除导致脂肪量增加。
一HuR-KFO和对照小鼠BAT、iWAT和eWAT中HuR表达的Western blot分析。b条雄性HuR-FKO和对照的体重(HuR公司弗洛克斯)鼠标（Ctrl，n个 = 7; HuR-FKO，n个 = 10).c（c）通过EcoMRI对3个月大的雄性HuR-FKO和对照鼠的体内脂肪和瘦肉质量进行研究。（Ctrl键，n个 = 8; HuR-FKO，n个 = 9).d日将3个月大的HuR-FKO和对照同窝婴儿的BAT、iWAT和eWAT器官重量标准化为总体重的百分比。n个 = 每组9个。e（电子）BAT、iWAT和eWAT的代表性图片。（f）通过H&E染色和F4/80免疫染色对eWAT进行形态学特征分析。比例尺代表200 微米。克HuR-FKO和Ctrl小鼠eWAT中胰岛素诱导的AKT磷酸化。注射IP胰岛素5分钟后，处死小鼠以获取eWAT，并通过western blot检测其AKT磷酸化水平。小时糖耐量试验（GTT）期间的血糖水平(n个 = 每组9人）和我HuR-FKO和对照窝友的胰岛素耐受性试验（ITT）（Ctrl，n个 = 8; HuR-FKO，n个 = 6). 误差线为平均值 ± SEM。统计显著性由Student’st吨-测试*第页 < 0.05. 源数据以源数据文件的形式提供。
图3
图3。HuR基因敲除增强eWAT中的脂肪生成和炎症。
一GSEA用于分析eWAT中HuR缺失影响的途径。散点图描述了第页-MSigDB中50个“Hallmark”基因集的值和标准化富集分数（NES）。重要的生物途径用红色标记。b条脂肪生成途径中的GSEA。c（c）实时PCR确认白色脂肪和脂肪生成基因的表达（Ctrl，n个 = 6; HuR-FKO，n个 = 7).d日实时PCR以确认脂肪生成和葡萄糖摄取基因的表达（Ctrl，n个 = 6; HuR-FKO，n个 = 7).e（电子）GSEA在干扰素γ应答和（f）炎症反应途径。每块面板的底部显示了在生物途径的前沿子集中发现的代表性基因的热图。颜色强度代表中位基因表达（FPKM），红色和蓝色分别代表高表达基因和低表达基因。克实时PCR确认炎症相关基因的表达。n个 = 每组10人。误差线为平均值 ± SEM。统计显著性由Student’st吨-测试*第页 < 0.05. 源数据以源数据文件的形式提供。
图4
图4。HuR基因敲除增强iWAT中的脂肪生成和褐变。
一GSEA用于分析iWAT中HuR缺失影响的途径。散点图描述了第页-MSigDB中50个“Hallmark”基因集的值和NES得分。b条GSEA对脂肪生成的生物途径，c（c）脂肪酸代谢，以及d日氧化磷酸化。e（电子）实时PCR确认脂肪生成、脂肪生成和（f）BAT选择性和米色脂肪标记（Ctrl，n个 = 6; HuR-FKO，n个 = 9).克Western blot检测HuR-FKO和Ctrl小鼠iWAT中Cidea和Ucp1的蛋白水平。小时HuR-FKO iWAT和eWAT中的调节路径显示在热图中。颜色表示每个路径的NES。误差线为平均值 ± SEM。统计显著性由Student’st吨-测试*第页 < 0.05.
图5
图5。BAT中HuR的缺失促进棕色脂肪生成。
一GSEA对HuR-FKO和Ctrl-BAT的检测表明，HuR基因敲除BAT中的肌生成途径显著下调。b条实时PCR确认BAT选择标记、脂肪生成、脂肪生成（Ctrl，n个 = 6; HuR-FKO，n个 = 7） 、和c（c）肌肉标记物（Ctrl，n个 = 6; HuR-FKO，n个 = 8).d日Western印迹检测HuR-FKO和Ctrl小鼠BAT中Ucp1、Pgc1a和Desmin的蛋白水平。e（电子）HuR-BATKO和对照小鼠BAT、iWAT和eWAT中HuR表达的Western blot分析。（f）H&E染色法研究HuR-BATKO和对照的形态特征。比例尺代表100 微米。克实时PCR以确认HuR-BATKO和Ctrl小鼠BAT中BAT选择性标记和脂肪生成基因的表达（Ctrl，n个 = 6; HuR-BATKO，n个 = 7). 误差线为平均值 ± SEM。统计显著性由Student’st吨-测试*第页 < 0.05. 源数据以源数据文件的形式提供。
图6
图6。HuR瞄准并稳定Insig1。
一Western blot，通过抗HuR抗体确认IP样品中存在HuR蛋白。b条圆图描绘了使用Ctrl中前200个最丰富的HuR-结合基因生成的前10个最重要的生物过程。内圈由GO过程的重要性着色。外圆表示浓缩的散点图（对数2（Ctrl/HuR-FKO））用于每个GO术语中发现的所有基因。c（c）绘制FKO和对照样品之间靶基因和其他基因的折叠变化的累积分数曲线。科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫试验。d日实时PCR确认Insig1在BAT、iWAT和eWAT中的表达（Ctrl:n个 = 6; HuR-FKO：n个 = 8).e（电子）RIP分析附睾白色脂肪组织中的抗HuR抗体，从HuR-FKO和对照同窝卵中裂解，以检测IP样品中Insig1 mRNA的数量。Fabp4被用作对照。将IP反应中5%的组织裂解物用作输入（Ctrl，n个 = 三；HuR-FKO，n个 = 6） 。（f）Insig1 3′UTR中HuR识别RNA片段的RNA下拉分析（详见方法）。克psiCHECK2报告子的全长Insig1 3′UTR（上部）或突变的3′UTR-没有两个HuR-结合位点（下部）的图。小时,我质粒如图所示(克)与HuR过表达质粒或对照（XZ201）共转染293细胞。添加阿克霉素D以停止转录，然后进行实时PCR小时卢克，我hLuc和j个18 在时间课程中。将每个点的hRluc mRNA的剩余部分拟合到第一阶段衰减曲线中，以得出RNA半衰期。n个 = 每组6个。k从HuR-KFO和对照动物中分离出初级白色前脂肪细胞进行培养，然后诱导分化5天。加入放线菌素D以跟踪衰变速率。我18S mRNA作为对照。n个 = 每组5个。误差线为平均值 ± SEM。统计显著性由Student’st吨-测试*第页 < 0.05.
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