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.2020年1月1日；10(1):384-397.
doi:10.7150/thno.4008。 eCollection 2020。

Bax抑制剂1通过促进线粒体PHB2的保留来维持急性肾损伤中线粒体的稳态

金旺（Jin Wang） 1, 朱平军 1, 李瑞冰 1, 任军 2 三, 张颖梅 2 三, 郝周 1 2
附属公司

Bax抑制剂1通过促进线粒体保留PHB2来维持急性肾损伤中线粒体的稳态

金旺（Jin Wang）等。 治疗诊断科技. .

摘要

Bax抑制剂-1（BI1）为线粒体传递抗凋亡信号，而抑制素2（PHB2）与维持线粒体形态和功能有关。然而，它们在急性肾损伤（AKI）中的调节作用尚不清楚。方法：在AKI患者中，使用ELISA测定尿液和血浆中BI1的水平。利用ATP耗竭介导的代谢应激和原代小管细胞缺血再灌注损伤（IRI）建立AKI的实验模型BI1公司转基因小鼠。采用Western blots、ELISA、qPCR、免疫荧光、RNA沉默和结构域缺失分析评估BI1和PHB2在线粒体完整性保护中的作用。结果：AKI患者尿和血浆中BI1水平降低，其表达与肾功能呈负相关。然而，重建BI1公司在小鼠AKI模型中，AKI能够缓解肾衰竭、炎症和肾小管死亡。进一步的分子检查表明，BI1保护线粒体遗传完整性，减少线粒体氧化应激，促进线粒体呼吸，抑制线粒体过度分裂，改善线粒体吞噬功能，抑制线粒体凋亡。有趣的是，线粒体定位的PHB2水平是由BI1维持的，PHB2的敲除消除了BI1的线粒体和肾脏保护特性。此外，BI1通过与细胞质PHB2直接相互作用促进PHB2在线粒体内的滞留，以促进其线粒体输入。观察结果证实，BI1的C末端和PHB2的PHB结构域是BI1-PHB2交联所必需的。结论：我们的数据揭示了BI1作为肾小管功能主调节器的重要作用，通过维持PHB2的线粒体定位，揭示了抗AKI的新治疗前景。

关键词：AKI；BI1；PHB2。；线粒体；小管细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
缺血性AKI中的BI1水平受到抑制。(A-B）使用ELISA检测AKI患者尿液和血浆中的BI1蛋白水平。（C）收集AKI患者或其他健康对照者的尿沉渣，然后用免疫印迹法评估尿中BI1的表达。（D）AKI患者尿BI1含量与血清肌酐峰值水平的相关性。（E-F）BI1转基因小鼠的BUN和血清肌酐水平(BI1公司TG公司)和遭受肾缺血再灌注损伤（IRI）的野生型（WT）小鼠体内.（G-H）用H&E染色观察IRI后肾小管的结构变化。肾小管损伤（肾小管萎缩或扩张、刷状缘丢失、空泡化、上皮细胞脱落和肾小管基底膜剥落）的半定量分析评分为：0，正常；1, <10%; 2, 10%-25%; 3, 25%-50%; 4, 50%-75%; 5，20个随机场中75%至100%的受影响区域。（I-J）使用TUNEL染色确定小管死亡。AQP1染色近端小管。（K-L）F4/80促炎细胞的免疫荧光分析。（M-N）从再灌注肾脏中分离RNA，并使用qPCR测定Ccl2和IL-6的转录。实验重复至少三次，数据显示为平均值±SEM（n=6只小鼠或每组3个独立细胞分离）*第页<0.05.
图2
图2
在肾脏IRI下，BI1过度表达维持线粒体稳态。（A）通过qPCR分析复合物IV片段-GAPDH片段比率来确定mtDNA拷贝。（B）测定细胞ATP生成在体外.（C-D）使用XFe96细胞外通量分析仪测定线粒体OCR。（E-G）分别使用MitoSOX红色和CellROX™绿色试剂分析线粒体ROS（mito-ROS）和细胞质ROS（cyto-ROS）的水平。（H-I）使用免疫荧光测定线粒体分裂。通过计算线粒体碎片细胞的数量来量化线粒体分裂。（J-K）mt Kemia测定法用于评估酸性线粒体。534/458nm的比例用于量化酸性线粒体指数。实验重复至少三次，数据显示为平均值±SEM（n=6只小鼠或每组3个独立细胞分离）*第页<0.05.
图3
图3
BI1促进PHB2进入线粒体。（A-B） 体外在不同的IRI时间后，从小管细胞中分离出蛋白质。然后，收集线粒体和细胞溶质部分。用Western blots检测PHB2的表达。VDAC被用作线粒体部分的负荷控制，而GAPDH被用作细胞溶质部分的标记物。（C-D） 体内从再灌注肾中分离蛋白质，收集线粒体和细胞溶质组分。用Western blots检测PHB2的表达。VDAC被用作线粒体部分的负荷控制，而GAPDH被用作细胞溶质部分的标记物。（E-F）将抗BI1的siRNA（BI1-si）和对照siRNA（Ctrl-si）转染到初级肾小管细胞，然后测定线粒体PHB2（mito-PHB2）的表达。（G-H）在初级小管细胞中BI1公司TG公司首先分离WT小鼠的全线粒体部分（whole），然后收集线粒体外膜（MOM）和有丝分裂体（内膜+基质）部分。Western blotting分析PHB2在整体、有丝分裂体和MOM组分中的表达。ABCB10被用作有丝分裂体的负荷控制，而VDAC被用作MOM标记。（I-J）在正常条件下，将BI1 siRNA（BI1-si）、TIM23 siRNA（TIM23-si）和对照siRNA（Ctrl-si）转染至原代小管细胞。然后，测定PHB2的水平。（K-L）在mIRI条件下，将Myc-TIM23、HA-BI1和载体转染HK2细胞。此外，在测定PHB2之前，使用TIM23-si沉默感染HA-BI1的HK2细胞中的TIM23。实验重复至少三次，数据显示为平均值±SEM（n=6只小鼠或每组3个独立细胞分离）*第页<0.05.
图4
图4
BI1与PHB2相互作用，促进PHB2在肾IRI下定位到线粒体。（A）用抗BI1或抗PHB2抗体免疫沉淀初级肾小管细胞的细胞裂解物，然后用抗PHB2或抗BI1抗体免疫印迹。IgG被用作BI1和PHB2之间内源性相互作用分析的对照。（B）转染外源性HA-BI1和Myc-PHB2的HK2细胞免疫沉淀后裂解物的免疫印迹分析。（C-D）PHB2区域的测绘。将不同的PHB2突变体转染到HK2细胞中。然后，免疫沉淀和HK2细胞裂解物的免疫印迹。（电子版）将不同的BI1突变体转染到HK2细胞中，然后进行免疫沉淀分析。（G-H）在mIRI下，将不同的BI1突变体转染到HK2细胞。此外，TIM23-siRNA用于在用Myc-BI1突变体转染的HK2细胞中沉默TIM23。实验重复至少三次，数据显示为平均值±SEM（每组3个独立细胞分离）*第页<0.05.
图5
图5
线粒体中PHB2的滞留是BI1赋予肾保护作用的原因。（A）在mIRI之前，用HA-BI1或其突变体（HA-BIlΔC和HA-BIIΔN）转染HK2细胞。用qPCR测定线粒体拷贝数。（B-C）用XFe96细胞外通量分析仪测定转染HA-BI1和/或其突变体的HK2的线粒体OCR。（D）半胱天冬酶-9活性的ELISA检测。（E-F）将Myc-标记的PHB2突变体（Myc-PHB2ΔPHB、Myc-PHP2ΔC、Myc-CHB2△N）感染到HK2细胞中。此外，在mIRI之前将HA-BI1或载体构建到HK2细胞中。JC-1染色记录线粒体膜电位。（G-H）mt-Kemia法用于酸性线粒体观察。用534/458nm的比值量化酸性线粒体指数。（I-J）TUNEL细胞死亡分析。计算TUNEL凋亡细胞数。实验重复至少三次，数据显示为平均值±SEM（每组3个独立细胞分离）*第页<0.05.
图6
图6
PHB2敲除消除BI1诱导的肾脏保护.（A-B） BI1公司TG公司在IRI之前，小鼠接受静脉注射Scramb control或PHB2特异性siRNA（Ctrl-si或PHB2-si）。然后，使用BUN和肌酐水平测定肾功能。（C-D）HE染色观察IRI后或全肾小管结构的改变。肾小管损伤（肾小管萎缩或扩张、刷状缘丢失、空泡化、上皮细胞脱落和肾小管基底膜剥落）的半定量分析得分为：0，正常；1, <10%; 2, 10%-25%; 3, 25%-50%; 4, 50%-75%; 5，受影响区域的75%-100%来自20个随机字段。（E-F）TUNEL染色检测肾小管死亡。AQP1染色近端小管。（G-H）F4/80炎症细胞的免疫荧光测定。F4/80免疫信号用于评估肾脏炎症反应。（I-J）从再灌注肾脏中分离RNA，然后使用qPCR测定Ccl2和IL-6的转录水平。实验重复至少三次，数据显示为平均值±SEM（每组n=6只小鼠或3个独立的细胞分离物）*第页<0.05.
图7
图7
描述AKI中提议的BI1-PHB2信令模式的示意图。在生理环境中（如右图所示），BI1在线粒体转运蛋白TIM23的帮助下与PHB2相互作用，从而促进PHB2在线粒体中的滞留，保持线粒体内环境稳定和管状活性。病理应激，如IRI（如左面板所示），BI1缺失，导致MOM定位不良，PHB2易位到MIM。因此，PHB2丢失到细胞质中（失去线粒体保留），引发线粒体损伤。
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