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.2020年1月1日；11(2):311-323.
doi:10.7150/jca.33982。 eCollection 2020。

长非编码RNADCST1-AS1型通过与miR-873-5p和MYC形成正调控环促进三阴性乳腺癌细胞增殖和转移

李唐 1, 像陈雨黎 2, 荀堂 1, 大伟 三, Xinyu Xu（许新宇） 4, 冯燕 1
附属公司

长非编码RNADCST1-AS1型通过与miR-873-5p和MYC形成正调控环促进三阴性乳腺癌细胞增殖和转移

李唐等。 J癌症. .

摘要

背景：含有1-反义1的DC-STAMP结构域(DCST1-AS1型)是一种在三阴性乳腺癌（TNBC）组织中上调的长非编码RNA（lncRNA）。在这里，我们试图研究DCST1-AS1型.方法：使用LncRNA微阵列检测癌组织中差异表达的LncRNA。荧光就地杂交分析用于检测DCST1-AS1型在BT-549和MDA-MB-231细胞中。慢病毒系统、抑制剂、siRNA和过表达质粒用于获得和失去功能实验。采用集落形成实验、伤口愈合实验、CCK8实验、穿孔实验和流式细胞仪实验来研究其功能DCST1-AS1型荧光素酶分析用于验证MYC与启动子区域的结合以及miR-873-5p与DCST1-AS1型RNA免疫沉淀分析用于验证精氨酸2与miR-873-5p和DCST1-AS1型Western blotting用于测量蛋白质表达的变化。结果：与微阵列结果一致，我们发现DCST1-AS1型在TNBC组织样品和细胞系中均上调。DCST1-AS1型与远处转移和组织病理分级呈正相关。DCST1-AS1型分布于细胞核和细胞质中。击倒DCST1-AS1型抑制TNBC细胞增殖和转移，同时过度表达DCST1-AS1型促进TNBC细胞增殖和转移。我们确认了DCST1-AS1型TNBC细胞的表达受MYC调节。此外，我们发现DCST1-AS1型与TNBC组织中的miR-873-5p呈负相关，是miR-873-4p的直接靶基因。Argonaute 2参与了DCST1-AS1型和miR-873-5p，并促进DCST1-AS1型.相互作用DCST1-AS1型miR-873-5p最终上调胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）、MYC、CD44和淋巴增强因子1（LEF1）的表达。结论： DCST1-AS1型被MYC激活，并通过与miR-873-5p结合而降解，从而上调miR-873-5p下游蛋白IGF2BP1、MYC、LEF1和CD44的表达。MYC、，DCST1-AS1型miR-873-5p形成正调控环，促进TNBC细胞增殖和转移。

关键词：IGF2BP1；MYC；长非编码RNA；转移。；miR-873-5页。

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竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
DCST1-AS1型在TNBC组织中上调。（A）6对肿瘤样本和邻近正常组织样本中lncRNA的层次聚类分析。（B）使用火山图分析6484个差异表达的lncRNA（≥2倍；P<0.05）。其中，2464个上调，4020个下调。（C） DCST1-AS1型通过RT-qPCR分析肿瘤样本和邻近正常组织（n=30）中的表达。DCST1-AS1型表达水平归一化为GAPDH。方框图中的水平线代表中位数；方框表示四分位范围。使用Wilcoxon符号秩检验分析样本之间的显著差异。**，P（P）< 0.0001.（D）基于RT-qPCR的TNBC预测ROC曲线DCST1-AS1型表达式级别。AUC为0.952，95%CI和P（P）指示值，P（P）= 0.023.
图2
图2
DCST1-AS1型是一种真正的lncRNA，分布在细胞核和细胞质中。（A）的编码能力分析DCST1-AS1型,MYC公司作为编码基因对照HOTAIR公司作为非编码基因控制。（B）RT-qPCR检测DCST1-AS1型在BT-549、MDA-MB-231、HCC1937、MDA-MB-453和HBL-100细胞中。以乳腺上皮细胞系HBL-100为参考。数值代表平均值，条形代表三个独立实验的S.D。（C）RT-qPCR用于测定核/细胞质表达率DCST1-AS1型在BT-549和MDA-MB-231细胞中。U6被用作提取核糖核酸质量的内部参考，GAPDH被用作细胞质RNA提取质量的内部参照。数值代表平均值，条形代表三个独立实验的S.D。（D）FISH用于检测DCST1-AS1型用DAPI染色检测细胞核DCST1-AS1型用Cy3标记探针检测到。
图3
图3
击倒DCST1-AS1型抑制增殖和迁移。（A）用RT-qPCR检测DCST1-AS1型慢病毒转染后TNBC细胞中。*，与NC组相比，P<0.01。（B、C）CCK8试验和集落形成试验用于检测细胞增殖DCST1-AS1型击倒TNBC细胞。*，与NC组相比，P<0.01。（D、E）流式细胞术检测慢病毒转染后BT-549-si、MDA-231-si细胞的细胞周期和凋亡率，与NC组相比，P<0.01。（F、G）采用伤口愈合试验和穿孔试验测定细胞的迁移能力DCST1-AS1型击倒TNBC细胞。在迁移试验中，BT-549和MDA-MB-231细胞培养18小时，而在侵袭试验中，细胞培养24小时。*，与NC组相比，P<0.01。
图4
图4
的过度表达DCST1-AS1型促进TNBC细胞增殖和侵袭。（A）RT-qPCR用于检测DCST1-AS1型慢病毒转染后在MDA-MB-231和HBL-100细胞中表达。转录水平按照GAPDH标准化。*，与NC组相比，P<0.01。（B）进行CCK8分析以确定异位表达DCST1-AS1型对TNBC细胞增殖的影响#，与NC组相比，P<0.05。（C）流式细胞术用于检测过表达MDA-MB-231细胞的细胞周期变化DCST1-AS1型.（D）菌落形成分析用于确定DCST1-AS1型TNBC细胞的过度表达依赖于凤尾鱼的生长。*，与NC组相比，P<0.01。（E）Transwell分析用于确定上调DCST1-AS1型细胞侵袭。在迁移试验中，MDA-MB-231细胞培养12小时，HBL-100细胞培养24小时。在侵袭试验中，MDA-MB-231细胞培养24小时，HBL-100细胞培养48小时。*，与NC组相比，P<0.01。
图5
图5
DCST1-AS1型被MYC激活。（A）使用TCGA数据分析乳腺癌亚型中MYC的表达水平。**，P<0.0001。（B、C） DCST1-AS1型当向BT-549和MDA-MB-231细胞中添加MYC-siRNA或MYC-MAX抑制剂10058-F4（50μg/ml）时，表达降低。*，与NC组相比，P<0.01。（D） DCST1-AS1型当MYC过表达质粒转移到BT-549和MDA-MB-231细胞中时，表达上调，与NC组相比，P<0.01。（E）双重荧光素酶分析证实MYC与DCST1-AS1型启动子位点。Pro，发起人*，与NC组相比，P<0.01。
图6
图6
DCST1-AS1型是miR-873-5p的直接靶点。（A）miR-873-5p结合位点的预测DCST1-AS1型.（B）miR-873在30对TNBC组织及邻近正常组织中的表达。miR-873-5p表达水平归一化为U6。使用Wilcoxon符号秩检验分析样本之间的显著差异。*，P<0.01。（C）表达式之间的反向关系DCST1-AS1型和miR-873-5p。表达被归一化，相关分析采用皮尔逊相关系数，R2=0.6249，P<0.0001（D）RT-qPCR分析表明DCST1-AS1型转染miR-873-5p模拟物的BT-549和MDA-MB-231细胞的表达降低，P<0.01。（E）qPCR分析表明miR-873-5p的表达通过干扰DCST1-AS1型在BT-549和MDA-MB-231细胞中。*，P<0.01。（F）双重荧光素酶分析证实miR-873-5p与预测的结合位点结合DCST1-AS1型.WT，野生型。Mut，突变体。*，P<0.01。（G）mRNA稳定性分析：半衰期DCST1-AS1型BT-549细胞的半衰期缩短了6.22小时DCST1-AS1型MDA-MB-231细胞缩短3.46小时；18S rRNA被用作内部参考。*，P<0.01。（H）miR-873-5p和DCST1-AS1型在AGO2干扰后的BT-549细胞中，通过RT-qPCR检测。GAPDH被用作DCST1-AS1型，U6被用作miR-873-5p.*的内部参照物，P<0.01。（一）免疫印迹法检测AGO2干扰后BT-549细胞IGF2BP1蛋白水平。（J）金额DCST1-AS1型在miR-873-5p抑制剂或阴性对照存在的情况下，通过RT-qPCR测定与抗AGO2或IgG结合的miR-873-4p。*，P<0.01。
图7
图7
DCST1-AS1型调节miR-873-5p的下游蛋白。（A）利用TCGA数据分析BRCA中IGF2BP1的表达水平。**，P<0.0001。（B）TCGA数据分析表明，IGF2BP1在TNBC和管腔亚型中的表达水平高于正常对照组，具有显著差异，P<0.05，*，P<0.01。（C）利用TCGA数据分析IGF2BP1表达与BRCA患者预后的关系。P=0.0054。（D）Western blotting显示IGF2BP1、MYC、LEF1和CD44在DCST1-AS1型干扰细胞。（E）将miR-873-5p抑制剂转染BT-549-si细胞，通过Western blotting检测IGF2BP1蛋白的表达。（F）将miR-873-5p抑制剂转染到BT-549-si细胞中，并通过CCK8检测细胞增殖。*，P<0.01。（G）将miR-873-5p抑制剂转染到BT-549-si细胞中，并通过伤口愈合试验测量细胞迁移。*，P<0.01。
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