Inhibition of the leucine-rich repeat protein lingo-1 enhances RGC survival in optic nerve injury

doi:10.3892/etm.2019.8250

.2020年1月；19(1):619-629.

doi:10.3892/etm.2019.8250。 Epub 2019年11月27日。

抑制富含亮氨酸重复蛋白lingo-1提高视神经损伤RGC存活率

亚丹泉¹, 吴亚丽¹, 纵一战¹, 杨帆（Yangfan Yang）¹, 陈晓涛¹, 凯里·吴¹, 俞敏斌¹

附属公司

PMID： 31885701
预防性维修识别码： PMC6913235型
内政部： 10.3892/等2019.8250

抑制富含亮氨酸重复蛋白lingo-1提高视神经损伤RGC存活率

亚丹泉等。实验治疗学. 2020年1月.

.2020年1月；19(1):619-629.

doi:10.3892/etm.2019.8250。 Epub 2019年11月27日。

作者

亚丹泉¹, 吴亚丽¹, 纵一战¹, 杨帆（Yangfan Yang）¹, 陈晓涛¹, 凯里·吴¹, 俞敏斌¹

附属

¹中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室，广东广州510060。

PMID： 31885701
预防性维修识别码： PMC6913235型
内政部： 10.3892/等2019.8250

摘要

富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域的nogo受体相互作用蛋白1（lingo-1）在中枢神经系统的神经元和少突胶质细胞上选择性表达，并在神经修复中起负调节作用，这意味着它在视神经病变中的潜在作用。本研究的目的是确定腺相关病毒血清型2（AAV2）载体是否介导lingo-1短发夹RNA的转移可以减少神经挤压引起的轴突变性，促进轴突再生视神经（ON）损伤后体内.lingo-1的表达被打倒体内使用绿色荧光蛋白（GFP）标记的AAV2编码lingo-1 shRNA，通过玻璃体内注射在成年Sprague-Dawley大鼠体内。通过检测RGC的GFP标记，以及通过逆转录定量聚合酶链反应和western blotting定量lingo-1表达水平，确认AAV2-lingo-1-shRNA的沉默作用。大鼠接受玻璃体内注射AAV2-lingo-1-shRNA或阴性对照shRNA。玻璃体内注射后2周进行ON挤压（ONC）损伤。测定伤后不同时间点的RGC密度、损伤ON的病变体积和视觉电生理[闪光视觉诱发电位（F-VEP）]。ONC后，lingo-1-shRNA的转导降低了lingo-1的表达水平，并促进了RGC的存活。Lingo-1-shRNA促进ON组织修复和功能恢复。AAV2-lingo-1-shRNA对RGC影响的机制可能是Ser473蛋白激酶B（Akt）的磷酸化和作用于lingo-1下游的Akt信号通路的激活。目前的研究结果表明，抑制lingo-1可能会提高视网膜神经节细胞的存活率，并促进ON损伤后的功能恢复，这是一种有希望的修复视神经病变的潜在策略。

关键词：富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域的nogo受体相互作用蛋白1；视神经挤压；蛋白激酶B；视网膜神经节细胞；视觉功能。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
实验设计。（A）实验程序的示意时间表。在玻璃体内注射腺相关病毒载体两周后，对注射的眼睛进行ONC。在ONC前、ONC后2周和4周进行分析，包括RGC/ONs的形态、功能和电生理变化。（B） ONC程序（放大倍数×6）。黄色箭头表示ONC的位置。ONC，视神经挤压；RGC，视网膜神经节细胞。

**图2。**
Lingo-1-shRNA在RGC中的转染效率很高。注射后2周平板视网膜样品中（A）lingo-1-shRNA和（B）NC shRNA-GFP免疫染色的代表性图像。比例尺，50µm。（C）注射2周后lingo-1蛋白表达的代表性western blot图像和（D）半定量数据。（E）视神经lingo-1 mRNA水平的改变。误差条表示平均值的标准误差，n=5**P<0.01和***P<0.001。Lingo-1、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域的nogo受体相互作用蛋白1；视网膜神经节细胞；NC-shRNA，阴性对照shRNA；短发夹RNA；绿色荧光蛋白。

**图3。**
视神经挤压伤后不同组RGC存活率。视神经损伤两周后，通过RNA-结合蛋白多重剪接免疫荧光染色，在视网膜扁平支架的上、下、鼻和颞象限观察到存活的RGC。在距离光盘1 mm处拍摄到代表性图像。（A）视神经损伤后用假对照、NC-shRNA或AAV2-lingo-1-shRNA处理的RGC的代表性图像。比例尺=50µm；放大倍数，×100。（B）定量分析整个视网膜样本中存活RGC的平均数量。（C）不同视网膜象限中存活RGC的密度**P<0.01。Lingo-1、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域的nogo受体相互作用蛋白1；视网膜神经节细胞；NC-shRNA，阴性对照shRNA；短发夹RNA。

**图4。**
视神经的纵向组织切片。（A） NC-shRNA组视神经的典型组织学切片。（B-D）NC-shRNA组ONC后视神经组织学改变的详细信息。（E-G）lingo-1-shRNA组ONC后视神经组织学改变的详细信息。（H） lingo-1-shRNA组的代表性组织学切片。比例尺=50µm。分析NC-shRNA、lingo-1-shRNA和假手术组（I）逆行部位、（J）损伤部位和（K）顺行部位的神经腔面积（每组6只小鼠）*P<0.05。Lingo-1、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域的nogo受体相互作用蛋白1；ONC，视神经挤压；NC-shRNA，阴性对照shRNA；短发夹RNA；NS，不显著。

**图5。**
视神经的横向组织学切片。（A）假ONC组的代表性组织切片。假ONC组视神经（B）中枢、（C）中部和（D）外周部分的组织学改变细节。（E） NC shRNA组的代表性组织学切片。NC-shRNA组视神经（F）中枢、（G）中段和（H）外周部分的组织学改变详情。（一） lingo-1-shRNA组的代表性组织学切片。lingo-1-shRNA组视神经（J）中枢、（K）中段和（L）外周部分的组织学改变细节。^★，中部地区；^☆，中部地区；°，外围区域。比例尺=100µm。（M）显示视神经横切面观察部位的示意图。（N）对三组神经腔区域的定量分析显示，损伤损伤了视神经的中央、中部和外围部分，且损伤最严重的是视神经的中心部分。n=5*P<0.05和**P<0.01。Lingo-1、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域的nogo受体相互作用蛋白1；ONC，视神经挤压；NC-shRNA，阴性对照shRNA；短发夹RNA。

**图6。**
用F-VEP波形评估受损视神经的恢复。（A）银针电极的位置。^▲，参比电极；^★，记录电极；^✦，接地电极。红色表示老鼠的测试眼睛。（B）假手术组、NC-shRNA组和lingo-1-shRNA组ONC后4周的典型F-VEP追踪。Y轴刻度，25µV；x轴标度，ONC后2周和4周，10 ms（C）N1振幅。（D） ONC后2周和4周的N1潜伏期。误差条表示平均值的标准误差，n=10*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。Lingo-1、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域的nogo受体相互作用蛋白1；NC-shRNA，阴性对照shRNA；短发夹RNA；闪光视觉诱发电位F-VEP；NS，不显著。

**图7。**
p-Ser473在视神经中的表达。（A）假手术组、NC-shRNA组和lingo-1-shRNA组中具有代表性的免疫荧光染色图像显示p-Ser473表达（红色；标尺=100µm）。（B）损伤视神经Akt激活的蛋白质印迹分析。在视神经损伤四周后计算p-Akt与总Akt表达水平的比值。总蛋白水平归一化为β-肌动蛋白水平，n=5**与NC-shRNA组相比，P<0.01。Lingo-1、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域的nogo受体相互作用蛋白1；p-，磷酸化；NC-shRNA，阴性对照shRNA；短发夹RNA；Akt，蛋白激酶B。

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