Use of in-gel peroxidase assay for cytochrome c to visualize mitochondrial complexes III and IV

doi:10.1242/bio.047936

.2020年1月8日；9（1）：生物047936。

doi:10.1242/bio.047936。

凝胶内过氧化物酶法测定细胞色素的应用c（c）可视化线粒体复合体III和IV

Tsukasa Hara村¹, 柴田裕马¹, Ryosuke Amagai公司¹, Ayako Okado-Matsumoto先生²

附属公司

¹日本千叶县船桥市宫山2-2-1，东京大学理学院生物系274-8510。
²日本千叶市福纳巴什宫山2-2-1宫山东河大学理学院生物系274-8510ayako@bio.sci.toho-u.ac.jp。

PMID： 31852667
预防性维修识别码： PMC6955206型
内政部： 10.1242/生物047936

凝胶内过氧化物酶法测定细胞色素的应用c（c）可视化线粒体复合体III和IV

Tsukasa Hara村等。生理盐水开放. 2020.

.2020年1月8日；9（1）：生物047936。

doi:10.1242/bio.047936。

作者

Tsukasa Hara村¹, 柴田裕马¹, Ryosuke Amagai公司¹, Ayako Okado-Matsumoto先生²

附属公司

¹日本千叶县福纳巴什市宫山2-2-1，东吴大学科学院生物系，邮编274-8510。
²日本千叶市福纳巴什宫山2-2-1宫山东河大学理学院生物系274-8510ayako@bio.sci.toho-u.ac.jp。

PMID： 31852667
预防性维修识别码： PMC6955206型
内政部： 10.1242/生物047936

摘要

凝胶内活性测定（IGA）是一种强大的技术，它使用酶活性并比较线粒体呼吸链超复合物中检测到的条带的强度，适用于真核生物。然而，由于复合物III的底物泛喹诺酮难以进入，因此复合物III没有建立IGA。在这里，我们证明细胞色素c（c）（周期c（c）)在IGA上显示了过氧化物酶活性，作为复合物III和IV的组成部分。我们在IGA之前使用十二烷基硫酸钠（SDS）预培养，以在高分辨率透明天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（hrCN-PAGE）后松开凝胶中的复合物，这是蓝色天然PAGE的精制。利用增强化学发光溶液获得基于过氧化物酶活性的IGA信号。然后，将凝胶直接用于western blotting或hrCN/SDS二维PAGE。我们的研究结果表明，Cyt的IGAc（c）反映了配合物III和IV的间接活性。

关键词：增强化学发光；高分辨率透明天然聚丙烯酰胺凝胶电泳；凝胶内活性测定；线粒体呼吸链复合物；氧化磷酸化；超复杂。

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利益冲突声明

竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

**图1。**
**通过洗涤剂增强凝胶内过氧化物酶测定。**用hrCN-PAGE分离20μg/lane膜蛋白。与洗涤剂预培养后，用ECL溶液测定过氧化物酶活性。25.2、303.5和600的曝光时间信号显示了。信号e1–e6与图2相同。NP-40、NP-40代用品；十二烷基硫酸钠；海卫一，海卫一X-100；吐温，吐温20；DOC，脱氧胆酸。

**图2。**
**凝胶内过氧化物酶活性测定和western印迹后获得的信号的直接比较。**用hrCN-PAGE在3–14%梯度凝胶中分离20μg/lane膜蛋白。（A）在1%十二烷基硫酸钠溶液预培养后，用ECL溶液测定过氧化物酶活性。暴露时间58.5、270和300 显示了。e1–e6表示ECL溶液和western印迹检测到的信号。（B）塞浦路斯*c（c）*（反Cytc中，western blotting检测到1）、CIII（抗核I，2）和CIV（抗COX I，3），暴露时间分别为600、60和40 s、从左到右。e1–e6显示为在与图1A分子量相同的位置检测到的信号。w1–w6表示western blotting检测到的信号。塞浦路斯*c（c）*，细胞色素*c（c）*; CIII，杂岩III；CIV，复合物IV；IGA，凝胶内活性测定；科幻小说_n个四、_n个，超级复合体III_n个四、_n个.

**图3。**
**hrCN/SDS 2D-PAGE显示Cyt c与CIII和CIV的相关性**用1D hrCN-PAGE分离40μg膜蛋白。然后，将一维hrCN-PAGE凝胶条浸泡在变性溶液和烷基化溶液中，并将凝胶条放置在二维SDS-PAGE的顶部。（A）尽管Cytc（c）第一维hrCN-PAGE上的信号未显示，Cytc（c）通过凝胶内过氧化物酶分析（泳道1）和用抗Cyt的蛋白质印迹观察信号*c（c）*使用图2A和B-1所示的相同图像，显示（车道2）以便于比较。（B）塞浦路斯*c（c）*通过western blotting（抗细胞色素*c（c）*)暴露时间为110秒（C）重复使用相同的Cyt膜*c（c）*在110 s的暴露时间内检测到CIII（抗核I）和CIV（抗COX IV）。信号e1–e6和w3与图2相同。塞浦路斯*c（c）*，细胞色素*c（c）*; CIII，杂岩III；CIV，复合物IV；IGA，凝胶内活性测定；SCIII公司_n个四、_n个，超复合体III_n个四、_n个.

**图4。**
**线粒体翻译抑制剂耗尽N2a细胞中CIII和CIV线粒体编码成分**用线粒体翻译抑制剂氯霉素处理小鼠神经母细胞瘤N2a细胞120小时。（A）研究了氯霉素处理对成分蛋白质合成的影响。用SDS-PAGE分离经（+）或未经（-）氯霉素处理的N2a细胞的5μg/lane全膜蛋白，并用抗SDHA（A-1）、抗Core I（A-2）和抗COX I抗体（A-3）进行western blotting检测复合物II、III和IV的组分。然后，在不进行剥离过程的情况下，将抗COX IV复制到抗SDHA保护膜上，检测到复合物IV（A-4）。每个箭头表示SDHA（A-1）、核心I（A-2）、COX I（A-3）和COX IV（A-4）。星号表示PVDF膜上的SDHA信号未撕裂（A-4）。在3–14%梯度凝胶中，用hrCN-PAGE分离经（+）或未经（−）氯霉素处理的N2a细胞的（B，C）15μg/lane全膜蛋白。E1–E4表示通过western blotting（B）和ECL溶液（C）检测到的信号。免疫印迹法检测CIII（抗-Core I，B-1）和CIV（抗COX I，B-2），暴露时间分别为58和17s。E1–E4显示为在与分子量相同的位置检测到的信号。ECL溶液在预培养1%SDS溶液（C）后测定过氧化物酶活性。CII，复合体II；CIII，杂岩III；CIV，复合物IV；SCIIInIVn，超复合体IIIINIVn。

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