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.2020年1月14日;14(1):91-104.
doi:10.1016/j.stemcr.2019.11.004。 Epub 2019年12月12日。

干细胞衍生胰岛的保形涂层用于1型糖尿病患者的β细胞替代

附属公司

干细胞衍生胰岛的保形涂层用于1型糖尿病患者的β细胞替代

Aaron A股等。 干细胞报告. .

摘要

供体的缺乏和免疫抑制的需要限制了少数不稳定型1型糖尿病患者的胰岛移植。包裹干细胞衍生胰岛(SC胰岛)的移植可能会将胰岛移植的适用范围扩大到更大的患者群体。将经保形包被的胰岛移植到一个狭窄且血管充足的部位,可以在无免疫抑制的情况下,使完全MHC不匹配的糖尿病小鼠的糖尿病得到长期逆转。在这里,我们证明了从冷冻保存的细胞中重新聚集的人SC胰岛在体外表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌。重要的是,我们发现保形涂层的SC胰岛在体外的功能与未包膜的SC胰脏相当,保形涂层允许生理性胰岛素分泌。将SC胰岛移植到糖尿病NOD-scid小鼠的性腺脂肪垫中表明,未包膜和保形包膜的SC胰岛均能逆转糖尿病,并维持人体正常血糖80天以上。总的来说,这些结果为进一步评估适形涂层SC胰岛在较大物种中的安全性和有效性提供了支持。

关键词:1型糖尿病;藻酸盐;保形涂层;封装;胰岛素;胰岛移植;聚乙二醇;干细胞源性胰岛;硫烯点击化学;β细胞。

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数字

图1
图1
体外试验从冷冻保存的第6阶段末期5细胞(A–C)中重新聚集的第6期SC岛评估第6天-1期SC细胞的相控图像(A)在旋转烧瓶中以不同放大倍数解冻并重新聚集1(S6d2)至11(S6d12)天。比例尺,200μm。使用台盼蓝排除法和自动细胞计数法评估旋转烧瓶(n=3个重新聚集批次)中SC胰岛解冻后的活细胞产量(B)和存活率(C)。(D) 共聚焦图像(150μm厚z堆栈的最大投影)以及解冻和重新聚集后活/死染色阶段-6天-7(S6d7)、S6d9和S6d11的量化。比例尺,100μm。(E) SC胰岛中β细胞纯度占NKX6.1的百分比+C肽+与冷冻保存前的S5末端相比,S6末端的细胞重新聚集(n=3个分化批次)。S6d7、S6d9和S6d11 SC胰岛的(F–H)双硫腙(DTZ)染色(F)和静态GSIS功能(G和H)作为GSIS绝对胰岛素分泌(G)、指数和δ(H)(n=3孔/条件分析)。依次用2.8 mM葡萄糖(L)、20 mM糖(H)和30 mM KCl溶液刺激SC胰岛。比例尺,200μm。(I和J)通过流式细胞术(I)和GSIS(J)评估从冷冻保存的S5细胞中重新聚集的六批独立分化的S6 SC胰岛的特征(用2.8 mM葡萄糖[L]、20 mM葡萄糖[CH]、2.8 mM-葡萄糖[L]和30 mM KCl溶液连续刺激)。p<0.05;∗∗p<0.01;∗∗∗p<0.01。ns,未发现显著差异。所有误差线均来自标准偏差。
图2
图2
体外试验未封装和CC SC胰岛的评估(A)未封装(左、裸)和保形涂层(右、CC)S6d9 SC胰岛在不同放大倍数(顶部和中心)下的相位对照图像,并用双硫腙染色(DTZ,底部)。比例尺,200μm。(B) 涂布后48 h(S6d11)裸(左)和CC(右)SC胰岛的活/死图像(150μm厚z堆栈的最大投影)作为活(绿)/死(红)染色细胞(细胞核:蓝色)的共焦图像。比例尺,100μm。(C) 裸鼠(黑色)和CC(红色)S6d11 SC胰岛的耗氧率(OCR)按DNA含量标准化。(D) 胶囊完整性作为抗PEG(绿色)染色胶囊共焦图像的正交投影。细胞核:蓝色。比例尺,200μm。(E) 三个轴(M1、M2、M3)上的胶囊厚度定量(n=130个CC胰岛评估)。(F) 裸(黑色)和CC(红色)SC胰岛在封装为GSIS指数后48小时(S6d11)的GSIS功能,以及在用2.8 mM葡萄糖(L)、20 mM糖(h)、2.8 mM葡萄糖(L。ns,未发现显著差异。所有误差线均来自标准偏差。
图3
图3
封装方法比较体外试验(A–G)活(绿色)/死(红色)染色细胞(细胞核:蓝色)(右侧)的相控图像(左侧)和活/死共焦图像(150μm厚z堆栈的最大投影)以及未封装(A,裸体)的量化(单个数据点代表每个z级成像的生存率百分比)(G),CC(在使SC胰岛运行通过CC过程之前使用PEG和SH-PEG-SH-Xlinker作为预凝胶溶液以重悬SC胰岛)(B)、CC-no-Xlinker(在使SC胰岛运行通过CC过程之前使用不含SH-PEG-SH的PEG作为不能形成凝胶以重悬SC胰岛的溶液的溶液)(C),CC HBSS(使用HBSS作为溶液,在SC胰岛通过CC过程之前对其进行再悬浮)(D),使用静电液滴发生器微囊化1.2%MVG海藻酸盐(ALG)(E),以及1.2%MVG-海藻酸盐和PEG(PEGALG)(F)微囊化SC胰岛。比例尺,200μm。(H) 裸(黑色)、CC(红色)、CC no Xlinker(红色带黑色方块)、CC HBSS(红色带黑条纹)、ALG微胶囊(绿色)和PEGALG微胶囊(紫红色)S6d9 SC胰岛在2.8 mM葡萄糖(L)、20mM葡萄糖(H)、,和30 mM KCl溶液。∗∗p<0.01(n=3口井,按条件化验)。(一) 裸(黑色)和CC(红色)SC胰岛的灌流(100μL/min灌流,L:2.7 mM葡萄糖;H:20 mM葡萄糖,KCl:2.7 m葡萄糖和30 mM KCl溶液)归一化为L值。每种情况下四批裸胰岛和CC SC胰岛。ns,未发现显著差异。所有误差线均来自标准偏差。
图4
图4
在体内未封装和CC SC胰岛的评估与人类胰岛(A–E)相比,植入2.5k IEQ(绿色)、2k IEQ、1.25k IEQ,蓝色)HI(虚线)、未封装HI(A,虚线)或S6d11 SC胰岛(B,实线)后血糖正常的糖尿病NOD-scid小鼠的平均血糖(mg/dL)在性腺脂肪垫中。显示了在IPGTT(D)期间,受体小鼠的糖尿病逆转效率(C)和糖耐量(作为平均血糖)以及IPGTT得出的曲线下面积(AUC)。(F–I)IPGTT期间血糖正常小鼠的平均血糖(F)、糖尿病逆转效率(G)和受体小鼠的葡萄糖耐量(作为血糖)(H);AUC来源于糖尿病NOD-scid小鼠的IPGTT(I),在脂肪垫中移植2.5k IEQ(实线)或2k IEQ(虚线)CC(红色)SC胰岛。ns,未发现显著差异。POD 78–102时的平均血糖:2.5k IEQ HI,91±12 mg/dL;2k IEQ HI,77±16 mg/dL;1.25k IEQ HI,116±19 mg/dL;2.5k IEQ SC胰岛,118±80 mg/dL;2k IEQ SC胰岛,58±25 mg/dL;1.25k IEQ SC胰岛,246±162 mg/dL;2.5k IEQ CC SC胰岛,60±12 mg/dL;2k IEQ CC SC胰岛,58±11。中位反转时间:2.5k IEQ HI,1天;2k IEQ HI,2.5天;1.25k IEQ HI,12天;2.5k IEQ SC胰岛,58天;2k IEQ SC胰岛,32天;125k个IEQ SC胰岛,83天;2.5k IEQ CC SC胰岛,29天;2k IEQ CC SC胰岛,39天;2.5k IEQ CC SC胰岛,21天;2k IEQ CC SC胰岛,45天。所有误差线均来自标准偏差。
图5
图5
小鼠移植后早期和晚期HI和SC胰岛移植物的组织学特征(A)人类胰岛(顶部)、未包膜SC胰岛(中部、裸体)和CC SC胰岛脂肪垫移植物5μm厚切片的H&E染色光镜图像(左侧)和共聚焦显微镜图像(右侧)化学性糖尿病STZ小鼠植入后30天内(POD<30),使用可吸收生物支架对胰岛素(绿色)、胰高血糖素(红色)、巨噬细胞(裸体,青色;CC,绿色)、α-平滑肌肌动蛋白(αSMA;CC,红色)和细胞核(DAPI,蓝色)进行染色。(B和C)INS量化+GLU公司+多激素(PH)细胞占所有INS的百分比+细胞(B)和移植物成分的定量(以INS的百分比表示)+所有INS中的β细胞+单元格或GLU+POD<30和POD>100时裸(NK)和CC HI和SC胰岛移植物的细胞(C)。ns,无显著差异。NK HI:POD<30 n=2,POD>100 n=6;NK-SC胰岛:POD<30 n=3,POD>100 n=7;CC HI:POD<30 n=2,POD>100 n未评估;CC SC胰岛:POD<30 n=4,POD>100 n=8。(D–F)裸体人类胰岛(D)、裸体SC胰岛(E)和CC-SC胰岛(F)移植于POD>100的脂肪垫移植物的5μm厚切片的H&E染色光镜图像(左侧)和共焦显微镜图像(右侧),对胰岛素(绿色)、胰高血糖素(红色)、巨噬细胞(青色)和细胞核(DAPI,蓝色)进行染色(左侧)胰岛素(绿色)、αSMA(红色)和细胞核(DAPI,蓝色)(右侧面板)。移植剂量:最高,2k IEQ;底部,2.5k IEQ。比例尺,100μm。(G) 作为MAC2的移植物过滤巨噬细胞的定量+分析裸(NK)和CC HI(裸:n=8;CC:n=2)和SC胰岛(裸:n=3;CC:n=9)移植物每平方毫米移植物组织中的细胞数。(H) 对裸(NK)和(CC)HI(裸:n=8;CC:n=2)和SC胰岛(裸:n=3;CC:n=9)移植物进行分析,以每平方毫米移植物组织中任意单位(a.u.)的αSMA患病率量化移植物纤维化。所有所示比例尺代表100μ。所有误差线均来自标准偏差。

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