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.2019年12月13日；15（12）：e1008526。
doi:10.1371/journal.pgen.1008526。 eCollection 2019年12月。

全基因组分析显示硫酸乙酰肝素异构酶调节TDP-43蛋白病

妮可·F·利亚奇科 1 2, 阿伦·德·萨克斯顿 1, 帕梅拉·麦克米兰 三, 蒂莫西·斯特罗瓦斯 1, C德克·基恩 4, 托马斯·D·伯德 1 5 6, 布莱恩·克莱默 1 2 三 6
附属公司

全基因组分析显示硫酸乙酰肝素异构酶调节TDP-43蛋白病

妮可·F·利亚奇科等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

病理性磷酸化TDP-43蛋白（pTDP）沉积导致肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶变性（FTLD-TDP）的神经变性。然而，病理性TDP-43毒性的细胞和遗传机制尚未完全阐明。为了鉴定TDP-43神经毒性的遗传修饰物，我们使用了一种表达人类突变TDP-43泛神经性（TDP-43 tg）的TDP-43蛋白病秀丽隐杆线虫模型。在TDP-43 tg线虫中，我们对16767个线虫基因进行了全基因组RNAi筛查，以检测TDP-43驱动的运动功能障碍的功能缺失基因抑制因子。我们确定了46个候选基因，当敲除这些候选基因时，可以部分改善TDP-43相关表型；其中24个候选基因在人类基因组中具有保守同源性。为了严格验证RNAi发现，我们将TDP-43转基因交叉到纯合性强遗传功能丧失突变的背景中。我们已经确认24个候选基因中的9个显著调节TDP-43转基因表型。在我们关注的已验证基因中，防止pTDP积累和运动障碍的最一致的遗传修饰基因之一是硫酸乙酰肝素修饰酶hse-5，它是秀丽线虫葡萄糖醛酸差向聚合酶（GLCE）的同源物。我们发现，在培养的人细胞中敲低人GLCE可以保护细胞免受氧化应激诱导的pTDP积累。此外，与正常对照组相比，FTLD-TDP患者大脑中葡萄糖醛酸差向异构酶的表达显著降低，这表明所确定的候选基因具有潜在的疾病相关性。综上所述，这些发现提名葡萄糖醛酸差向异构酶作为TDP-43蛋白病（包括ALS和FTLD-TDP）的新候选治疗靶点。

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数字

图1
图1。全基因组RNAi屏幕在几个功能类别中识别TDP-43抑制物。
(A类)TDP-43诱导的不协调运动（Unc）修饰物的RNAi筛选流程图。(B类)每个功能组中确定的抑制器的百分比。在人类基因组中没有显著比对的基因没有被划分为功能组。
图2
图2。TDP-43抑制剂改进C类.雅致运动功能和降低有毒TDP-43水平。
(A类)评估了人类突变TDP-43（M337V）转基因双纯合动物的运动功能、TDP-43 tg和指示抑制基因的功能丧失突变。通过计算从指定中心起点经过一段时间的径向距离来测量发育阶段L4幼虫的分散速度，对于所有测试菌株，N>200。采用Tukey多重比较试验对受试菌株进行单向方差分析，以评估其显著性***p<0.0001，*p<0.01与TDP-43 tg相比。非tg（N2）动物移动3.712μm/sec(B类)为了检测与TDP-43 tg转基因（Chr IV）位于同一染色体上的抑制基因的功能丧失突变的影响，在不同染色体（Chr II）上使用了第二个人类突变TDP-43（A315T）转基因，即TDP-43 tg2。如上所述，对TDP-43 tg2转基因的双纯合动物和TDP-43抑制基因的失能突变进行运动功能评估，所有测试菌株的N>200***与TDP-43 tg2相比，p<0.0001，**p<0.001，*p<0.01。(C-G公司)通过免疫印迹法测量总的和磷酸化的TDP-43蛋白的水平。所示数据代表了三次独立实验。图表绘制了相对总TDP-43或磷酸化TDP-43信号，标准化为来自三个或更多独立复制实验的微管蛋白水平。采用Mann-Whitney试验评估受试菌株之间的显著性*p<0.05。
图3
图3。hse-5功能丧失恢复TDP-43 tg的突触传递C类.雅致.
(A类)为了评估神经退行性变，在L4期对GFP标记的D型GABA能运动神经元进行计数体内活的虫子。TDP-43甘油三酯；hse-5（tm472）与单独TDP-43 tg相比，动物损失的神经元略多，所有测试菌株的N>33。采用Tukey多重比较试验对受试菌株进行单向方差分析，以评估其显著性*p<0.05，非Tg对TDP-43 Tg，TDP-43 Tg对TDP-43tg；hse-5（tm472），NS=不显著。(B类)在第1天成人，TDP-43 tg和TDP-43 tg之间的D型GABA能运动神经元数量没有差异；hse-5（tm472）对于所有测试菌株，N>33。NS=不显著。非Tg对TDP-43tg和TDP-43 Tg的p<0.0001；hse-5（tm472）. (C类)hse-5（tm472）表现出许多轴突异常，包括异常分支、环状和异体间连接。这些非规范过程在TDP-43 tg中增加；hse-5（tm472）动物，所有测试菌株的N>33***非Tg与hse-5（tm472）TDP-43tg和TDP-43 tg；hse-5（tm472）以及TDP-43tg与TDP-43 tg的对比；hse-5（tm472）. (D类)野生型控制轴突从腹侧神经索线性上升，没有分支、环状或轴突间连接。(E-F公司)TDP-43甘油三酯；hse-5（tm472）轴突经常表现出不寻常的分支、环或异体间连接。（G）使用涕灭威敏感性试验评估突触前传播。在指定的瘫痪时间点对动物进行评分。绘制了三个独立的实验。相对于非tg动物（蓝色圆圈），TDP-43 tg动物（橙色菱形，第3-7小时p＜0.005）对涕灭威具有强烈的抗性，表明突触传递减少或有缺陷，而hse-5（tm472）动物（红色方块，3-4小时时p<0.05）对涕灭威的抗性较弱。TDP-43甘油三酯；hse-5（tm472）动物（黑圈，3-5小时时p<0.05）的突触传递恢复到hse-5（tm472）水平。unc-29（e1072）（紫色倒三角形，3~7小时时p<0.05）和unc-31（e928）（绿色三角形，第3小时和第4小时p<0.05）是涕灭威敏感性降低的对照。采用双向方差分析和Tukey多重比较检验评估显著性；p值与非Tg相比。
图4
图4。哺乳动物培养细胞和FTLD-TDP中GLCE的变化。
(A-B公司)用乙基丙烯酸（EA）处理的培养的HEK293细胞积累强大水平的磷酸化TDP-43。(A类)经处理的细胞的代表性免疫印迹GLCE公司-靶向siRNA在EA存在下表现出减少pTDP积累。（B）对三种硅酸盐的独立实验进行量化并绘制图表。采用Tukey多重比较试验对受试菌株进行单向方差分析，以评估其显著性**p=0.0029，***p=0.0002与电针治疗组比较。(C-D公司)与正常对照组相比，FTLD-TDP患者的GLCE免疫反应性降低。(C类)对14名FTLD-TDP患者和12名正常对照者额叶皮层深层（额叶中回）GLCE免疫反应的定量。采用非配对t检验评估显著性，*p=0.0116。(D类)患者和对照组额叶皮质GLCE免疫染色的代表性图像。pTDP-43在FTLD-TDP患者的同一脑区明显积聚。比例尺=50um。
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