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.2020年1月；56(1):151-164.
doi:10.3892/ijo.2019.4933。 Epub 2019年12月3日。

膀胱癌细胞分泌的外体miR‑21激活巨噬细胞中的PI3K/AKT通路，促进肿瘤进展

范琳 1, 胡斌寅 1, 李新源 1, 龚敏珠 1, 魏阳河 1, 新沟 1
附属公司

膀胱癌细胞分泌的外体miR‑21激活巨噬细胞中的PI3K/AKT通路，促进肿瘤进展

范琳等。 国际癌症杂志. 2020年1月.

摘要

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）构成肿瘤微环境的主要组成部分，并在肿瘤转移前形成于该微环境。然而，TAM在膀胱癌中重塑的详细机制尚未明确。本研究收集了人膀胱T24癌细胞条件培养液中的外泌体。Transwell分析法分析了T24细胞外泌体处理的巨噬细胞对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响。用逆转录定量PCR检测内源性和外源性microRNA‑21（miR‑21）的表达水平，用western blot分析靶蛋白的表达水平。荧光素酶报告质粒和突变体用于确认直接靶向性。通过转染miR‑21后的Transwell和Matrigel分析，分析miR鄄21对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响。经鉴定，来自膀胱癌细胞的外泌体将THP‑1细胞衍生的巨噬细胞极化为M2表型，并测定了TAM介导的促迁移和促侵袭活性。此外，还发现miR‑21在来自膀胱癌细胞的外泌体以及经外泌物体处理的巨噬细胞中高度表达。此外，转染miR‑21的巨噬细胞表现出M2极化，并促进T24细胞迁移和侵袭能力。从机制上讲，来自膀胱癌细胞的外体miR‑21抑制巨噬细胞中PI3K/AKT信号通路的磷酸酶和张力蛋白同系物激活，并增强STAT3表达以促进M2表型极化。目前的结果表明，外体miR‑21可以通过极化TAM促进癌症进展。

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数字

图1
图1
PMA处理的THP-1细胞的特征。（A） PMA处理引起THP-1细胞的形态学变化。用100ng/ml PMA处理THP-1细胞24小时，以分化为静息巨噬细胞。放大倍数，×100。（B） PMA刺激THP-1细胞产生巨噬细胞的流式细胞术分析；CD11b和CD14是巨噬细胞的特异性标记物。PMA，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸盐。
图2
图2
T24细胞源性外泌体的特征和外泌体内化为免疫细胞。（A） T24细胞外泌体的典型TEM显微照片。（B） 来源于T24细胞的外泌体中的外泌体蛋白CD9、CD63和TSG101的蛋白质印迹分析。（C） 通过超速离心分离的T24细胞源性外泌体的NTA。（D） 共聚焦显微镜下显示，来源于T24细胞的PKH67标记的外泌体被摄取并内化到巨噬细胞的细胞质中。显示了具有代表性的图像。比例尺，100µm.透射电镜；TSG101，肿瘤易感基因101；NTA，纳米粒子跟踪分析；外显子，外显子体。
图3
图3
来源于T24细胞的外泌体诱导M2巨噬细胞的极化，并可促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭。（A） RT-qPCR检测对照组、非CM-处理的巨噬细胞和外处理的巨噬细胞中IL-10和TGF-βmRNA的表达。（B） 用ELISA测定IL-10和IL-12（p70）水平。（C） T24细胞与来自对照、未经处理、未经o-CM-处理或外处理巨噬细胞的上清液培养的迁移和侵袭试验。放大倍数，×100。n=3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****与对照组相比P<0.01。RT-qPCR、逆转录定量PCR；非o-CM，非小体条件培养基；外泌物，外泌体。
图4
图4
miR-21在T24细胞源性外泌体中富集，并与M2巨噬细胞极化有关。（A） T24细胞和外泌体中miR-21的相对表达。（B） 经PBS或外泌体处理的巨噬细胞中miR-21的相对表达。（C） 与T24细胞或抗miR-21-5p T24细胞共同培养的巨噬细胞中miR-21的相对表达。（D） 与T24细胞或抗miR-21-5p T24细胞共同培养的巨噬细胞中IL-10和TGF-βmRNA水平。（E） 转染miR-21-5p模拟物或miR-21-5 p抑制剂的巨噬细胞的miR-21水平。（F） 转染miR-21-5p模拟物的巨噬细胞中IL-10和TGF-βmRNA水平。（G） 转染miR-21-5p抑制剂的巨噬细胞中IL-10和TGF-βmRNA水平。n=3。▲▲与T24组相比，P<0.01*P<0.05，**P<0.01，***与对照组相比，P<0.001。#P<0.05，##P<0.01，###与NC组相比，P<0.001。miR-21，microRNA-21；外显体；对照组，巨噬细胞与T24细胞或巨噬细胞共同培养；NC，巨噬细胞与转染相应阴性对照的T24细胞或转染阴性对照的巨噬细胞共同培养；抗miR-21-5p T24，巨噬细胞与转染miR-21-5抑制剂的T24细胞共同培养；模拟物，用miR-21-5p模拟物转染的巨噬细胞；抑制剂，巨噬细胞转染miR-21-5p抑制剂。
图5
图5
上调巨噬细胞miR-21的表达可以促进T24细胞的迁移和侵袭。（A） 通过Transwell和Matrigel分析评估转染miR-21-5p模拟物的巨噬细胞处理的T24细胞的细胞迁移和侵袭。放大倍数，×100。（B） 转染miR-21-5p抑制剂的巨噬细胞对T24细胞迁移和侵袭的影响。放大倍数，×100。n=3。**P<0.01，***P<0.001，****与对照组相比，P<0.0001；###P<0.001，####与NC组相比，P<0.0001。miR-21，microRNA-21；NC，阴性对照。
图6
图6
miR-21下调巨噬细胞PTEN表达并激活PI3K/AKT介导的STAT3信号通路。（A） 用TargetScan预测了miR-21-5p在PTEN 3’-UTR中的结合位点。（B） 用WT或MUT PTEN编码序列载体转染M0巨噬细胞。转染24小时后测定荧光素酶活性。（C） 外泌体处理的巨噬细胞PTEN mRNA水平。（D） 转染miR-21-5p模拟物或miR-21-50p抑制剂的巨噬细胞PTEN表达。（E） PTEN抑制剂SF1670（1µM） 抑制转染miR-21-5p抑制剂的巨噬细胞PTEN的表达。（F） 用SF1670（1）处理miR-21抑制转染细胞后，IL-10和TGF-β水平升高µM） ●●●●。miR-21下调巨噬细胞PTEN表达并激活PI3K/AKT介导的STAT3信号通路。（G） 通过western blot分析评估PTEN、PI3K、p-AKT和p-STAT3在外处理巨噬细胞中的表达。（H） 与T24细胞共培养的巨噬细胞与与抗miR-21-5p T24细胞共同培养的巨噬细胞之间PTEN、PI3K、p-AKT和p-STAT3表达的差异。（一） 转染miR-21-5p模拟物或miR-21-5抑制剂的巨噬细胞中PTEN、PI3K、p-AKT和p-STAT3的表达。n=3。▲▲与模拟NC组相比，P<0.01。☐☐与PTEN WT miR-21-5p组相比，P<0.01。*P<0.05，**与对照组相比P<0.01。#与NC组相比，P<0.05。ΔΔP<0.01，ΔΔΔ与抑制剂组相比，P<0.001。miR-21，microRNA-21；pmirGLO NC，pmirGLO-阴性对照；pmirGLO-PC，pmirGLO阳性对照；NC，阴性对照；MUT，突变；PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物；外显体；p-，磷酸化；3'-UTR，3'-未翻译区域。
图6
图6
miR-21下调巨噬细胞PTEN表达并激活PI3K/AKT介导的STAT3信号通路。（A） 用TargetScan预测了miR-21-5p在PTEN 3’-UTR中的结合位点。（B） 用WT或MUT PTEN编码序列载体转染M0巨噬细胞。转染24小时后测定荧光素酶活性。（C） 外泌体处理的巨噬细胞PTEN mRNA水平。（D） 转染miR-21-5p模拟物或miR-21-50p抑制剂的巨噬细胞PTEN表达。（E） PTEN抑制剂SF1670（1µM） 抑制转染miR-21-5p抑制剂的巨噬细胞PTEN的表达。（F） 用SF1670（1）处理miR-21抑制转染细胞后，IL-10和TGF-β水平升高µM） ●●●●。miR-21下调巨噬细胞PTEN表达并激活PI3K/AKT介导的STAT3信号通路。（G） 通过western blot分析评估PTEN、PI3K、p-AKT和p-STAT3在外处理巨噬细胞中的表达。（H） 与T24细胞共培养的巨噬细胞与与抗miR-21-5p T24细胞共同培养的巨噬细胞之间PTEN、PI3K、p-AKT和p-STAT3表达的差异。（一） 转染miR-21-5p模拟物或miR-21-5抑制剂的巨噬细胞中PTEN、PI3K、p-AKT和p-STAT3的表达。n=3。▲▲与模拟NC组相比，P<0.01。☐☐与PTEN WT miR-21-5p组相比，P<0.01。*P<0.05，**与对照组相比P<0.01。#与NC组相比，P<0.05。ΔΔP<0.01，ΔΔΔ与抑制剂组相比，P<0.001。miR-21，microRNA-21；pmirGLO NC，pmirGLO-阴性对照；pmirGLO-PC，pmirGLO阳性对照；NC，阴性对照；MUT，突变；PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物；外显体；p-，磷酸化；3'-UTR，3'-未翻译区域。
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