TRIM21介导的SAMHD1蛋白酶体降解调节其抗病毒活性
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PMID： 31797533 -
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内政部： 10.15252/embr.201847528
TRIM21介导的SAMHD1蛋白酶体降解调节其抗病毒活性
摘要
利益冲突声明
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A–D SAMHD1的表达与EV71病毒的复制能力呈负相关。 HEK293T和RD细胞感染EV71，MOI为0.1； 然后，在指定的时间点采集细胞和上清液。 （A） 用微管蛋白作为负荷对照，对细胞中EV71 VP1进行免疫印迹（IB）分析。 超速离心后检测上清液中的EV71‐VP1蛋白。 （B） 以GAPDH为对照，采用RT-qPCR检测细胞裂解液和上清液中EV71病毒RNA水平。 ( n个 =3，平均值±SD，ns表示无显著性，成对 t吨 试验）（C）通过RT-qPCR检测感染或未感染HEK293T或RD细胞中宿主限制因子的mRNA水平，并将目标基因的表达水平归一化为GAPDH。 ( n个 =3，平均值±SD，ns表示无显著性，成对 t吨 ‐测试）。 （D） 以微管蛋白作为负荷控制，对SAMHD1和BST-2蛋白水平进行IB分析。 用ImageJ软件分析条带密度，计算与微管蛋白的相对值。 E–J公司 SAMHD1击倒增强了EV71复制。 在HEK293T（E）和RD（H）细胞中构建的稳定细胞系pLKO.1和sh‐SAMHD1分别以0.1和0.05的MOI感染EV71，并在指定的时间点采集细胞和上清液。 以微管蛋白作为负荷对照，对细胞中EV71 VP1和SAMHD1进行IB分析。 超速离心后检测上清液中的EV71‐VP1蛋白。 以GAPDH为对照，RT-qPCR检测细胞裂解液中的（F和I）EV71病毒RNA( n个 =3，平均值±SD* P（P） < 0.05, ** 对 < 0.01，成对 t吨 ‐测试）。 用细胞病变效应法测定上清液中的（G和J）病毒滴度。 结果表示三个独立实验的平均值±SD。 使用Student的 t吨 ‐测试(* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01). K（K） 转染VR1012（真核表达载体）或Vpx‐HA的HEK293T细胞以0.1的MOI感染EV71，然后在指定的时间点采集细胞和上清液。 以微管蛋白作为负荷对照，对细胞裂解液中EV71‐VP1、SAMHD1和Vpx‐HA进行IB分析。 超速离心后，在上清液中检测到EV71‐VP1。 L（左） 以GAPDH为对照，RT-qPCR检测细胞裂解液中EV71病毒RNA( n个 =3，平均值±标准差** P（P） < 0.01，成对 t吨 ‐测试）。 M（M） 用细胞病变效应法测定上清液中的病毒滴度。 结果表示三个独立实验的平均值±SD。 使用Student’s t吨 ‐测试(** P（P） < 0.01).
A类 在HEK293T和RD细胞中构建稳定的SAMHD1-HA过表达细胞系，并用IB检测到pLVX作为阴性对照。 B类 RD SAMHD1‐HA细胞系在收获前用二甲基亚砜（DMSO）或10μM MG132处理12 h，并用微管蛋白作为负荷对照进行IB处理。 C类 RD SAMHD1‐HA细胞系按（B）中的方法处理，然后进行HA免疫沉淀（IP）和IB。 用质谱分析IP洗脱。 D、 E类 TRIM21（D）而不是TRIM25（E）诱导了SAMHD1的降解，MG132挽救了TRIM21介导的SAMHD1的降解。 HEK293T细胞在收获前与SAMHD1和VR1012或TRIM21或TRIM25表达质粒共转染，并与MG132处理或不处理共转染12 h，然后以微管蛋白作为负荷对照。 F类 反向联合IP证实了SAMHD1和TRIM21之间的相互作用。 用TRIM21‐HA将SAMHD1‐flag转染到HEK293T细胞中，然后按照（B）中的方法处理细胞，并对其进行HA IP和IB处理。 G公司 内源性TRIM21而非TRIM25仍与SAMHD1相互作用。 如（B）中处理的RD‐SAMHD1‐HA细胞接受TRIM21或TRIM25 IP和IB。 H、 我 （H） 信使核糖核酸( n个 =3，平均值±SD*** P（P） < 0.001，成对 t吨 ‐测试）和（I）RD和HEK293T细胞中TRIM21的蛋白质水平。 J、 K（K） TRIM21（J），但不是与SAMHD1共定位的TRIM25（K）。 图像在蔡司LZM710共焦显微镜下拍摄，Bars，10μm。
用打乱shRNA或TRIM21特异性shRNA处理的RD细胞的IB分析，微管蛋白作为负荷控制。 在指定的时间内，以0.05的MOI感染RD‐pLKO.1或RD‐shTRIM21‐3细胞，并采集用于IB检测SAMHD1、TRIM21和EV71‐VP1。Tubulin作为负荷控制。 以GAPDH为对照，采用RT-qPCR检测（B）中EV71 RNA水平( n个 =3，平均值±SD** P（P） < 0.01，成对 t吨 ‐测试）。 从三名健康献血者中分离出PBMC，并在0.1MOI感染EV71。 72小时后，采集PBMC并进行IB，以微管蛋白作为对照，检测SAMHD1、TRIM21和EV71‐VP1。 以GAPDH为对照，通过RT–qPCR检测PBMC中EV71的病毒mRNA水平( n个 =3，平均值±SD）。
A–D RD细胞中的TRIM21敲除释放SAMHD1对EV71复制的抑制。 （A） 细胞中gRNA引导的TRIM21敲除的图示。 （B） 阴性对照或RD‐CRISPR‐Cas9‐TRIM21 RD细胞在指定时间内以0.05的MOI感染EV71，并通过IB采集用于SAMHD1、TRIM21和EV71‐VP1检测。Tubulin作为负荷对照。 （C） 以GAPDH为对照，采用RT-qPCR检测（B）中EV71 RNA水平( n个 =3，平均值±SD** P（P） < 0.01，成对 t吨 ‐测试）。 （D） 用细胞病变效应法测定上清液中的病毒滴度。 结果表示三个独立实验的平均值±SD。 使用Student’s t吨 ‐测试(** P（P） < 0.01). E、 F类 TRIM21在HEK293T细胞中的过度表达通过降解SAMHD1增加EV71复制。 将VR1012或TRIM21‐HA转染HEK293T细胞24小时，然后以0.05的MOI感染EV71。 （E） 在指定的时间点采集细胞，并以微管蛋白作为负荷对照进行IB。 （F） 以GAPDH为对照，RT-qPCR检测细胞裂解液中EV71病毒RNA( n个 =3，平均值±SD** P（P） < 0.01，成对 t吨 ‐测试）。 G、 H（H） TRIM21本身对EV71的复制没有影响。 VR1012或TRIM21转染pLKO.1或sh‐SAMHD1 HEK293T细胞24小时，并感染EV71。 （G） 收集细胞并进行IB分析。 （H） 用细胞病变效应法测定上清液中的病毒滴度。 结果表示三个独立实验的平均值±SD。 使用Student的 t吨 ‐测试(* P（P） < 0.05).
A、 B 用siRNA-NC或siRNA-SAMHD1转染RD细胞中构建的稳定细胞系打乱的gRNA或TRIM21 gRNA，然后以0.1 MOI感染EV71。 48h后，收集细胞和上清液，并用IB（A）和滴度检测（B）进行分析。上清液中的病毒滴度用细胞病变效应法进行测定。 结果表示三个独立实验的平均值±SD。 使用Student’s t吨 ‐测试(* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01). C类 用100μg/ml环己酰亚胺（CHX）和DMSO或10μM MG132处理RD细胞中构建的稳定细胞系打乱的gRNA或TRIM21 gRNA。 在指定的时间点采集细胞，然后使用IB进行分析。使用ImageJ软件分析条带密度，以计算与微管蛋白相对的值。 D、 E类 在HEK293T细胞中构建的稳定细胞系pLKO.1或sh‐SAMHD1以0.1的MOI感染RSV，然后在指定的时间点采集细胞。 以微管蛋白作为负荷对照，对RSV蛋白和SAMHD1进行IB分析。 （F） SAMHD1在24小时内抑制VSV。 将VR1012或TRIM21转染到pLKO.1或sh‐SAMHD1 HEK293T细胞中24 h，然后在0.01 MOI下感染VSV‐GFP。 在指定的时间点，通过枚举GFP阳性细胞来测量VSV的感染性。 ( n个 =3，平均值±SD* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01，成对 t吨 测试）。
A、 B EV71感染后，IFN‐α和IFN∙β以及SAMHD1和TRIM21的mRNA水平上调。 HEK293T和RD细胞在0.05MOI感染EV71后不同时间收获，以GAPDH为对照，采用RT-qPCR检测IFN-α、IFN-β（A）、TRIM21和SAMHD1（B）mRNA水平( n个 =3，平均值±SD）。 C类 TRIM21是干扰素诱导蛋白。 用IFN‐α（100 U/ml）刺激THP1-pLKO.1或THP1-shTRIM21细胞24 h，然后以微管蛋白为对照，用Western blot检测SAMHD1和TRIM21。 D、 E类 EV71感染上调TRIM21依赖于IFNAR1。 （D） 通过RT-qPCR检测确认IFNAR敲除( n个 =3，平均值±SD*** P（P） < 0.001，成对 t吨 ‐测试）。 （E） 如图所示，用SAMHD1 siRNA转染RD‐pLKO.1和RD‐shIFNAR细胞，然后在0.05 MOI下感染EV71，并在IB感染72 h后采集用于SAMHD1、TRIM21和EV71‐VP1检测，以微管蛋白作为对照。 F类 EV71非结构蛋白对SAMHD1的表达没有影响。 将SAMHD1+VR1012或指示的EV71非结构蛋白转染HEK293T细胞48 h，并以微管蛋白作为负荷对照进行IB分析； EV71非结构蛋白的印迹用星号标记。
A类 以GAPDH为对照，通过RT–qPCR检测新生小鼠不同组织中SAMHD1和TRIM21的mRNA水平，并将SAMHD1和TRIM21在心脏中的表达设定为100%( n个 =3，平均值±SD* P（P） < 0.05，成对 t吨 ‐测试）。 B类 以微管蛋白为对照，通过近红外光谱（NIR）蛋白质印迹检测小鼠不同组织中SAMHD1和TRIM21的蛋白质水平。 C类 SAMHD1在小鼠不同组织中的免疫组织化学（IHC）染色结果。 棒材，100μm。 D–F型 以GAPDH为对照，通过RT-qPCR检测模拟或EV71感染小鼠中EV71病毒和宿主因子的mRNA水平。 检测了EV71（D）、IFN‐α和IFN∙β（E）以及SAMHD1和TRIM21（F）的表达，并将模拟感染小鼠的相应基因水平设为100%( n个 =3，平均值±SD** P（P） < 0.01，成对 t吨 ‐测试）。
A–I类 （A） 用打乱的shRNA、TRIM21特异性shRNA或SAMHD1特异性shRNA.管蛋白作为负荷控制，对THP‐1细胞进行IB分析。 （B，E，H）量化整个细胞中SAMHD1和TRIM21水平，其中指示的基因被shRNA敲除。数据被归一化为微管蛋白，并表示为未感染HIV的pLKO.1处理细胞的折叠变化( n个 =3，平均值±SD）。 （C） 用PMA处理sh‐SAMHD1和sh‐TRIM21 THP‐1细胞24小时，并感染VSV‐G假型报告病毒HIV-1，48小时后通过流式细胞仪分析检测( n个 =3，平均值±SD* P（P） < 0.05, ** 对 < 0.01, *** P（P） < 0.001，成对 t吨 ‐测试）。 （D） 在MDM分化后的第1天和第3天，对分别转染TRIM21 siRNA两次的三名捐赠者的MDM细胞进行IB分析。 （F） 用TRIM21 siRNA处理的MDM细胞感染VSV‐G‐假型HIV‐1报告基因，48小时后通过流式细胞术分析检测( n个 =3，平均值±SD** P（P） < 0.01，成对 t吨 ‐测试）。 （G） 干扰shRNA或TRIM21特异性shRNA处理的Jurkat和KG‐1细胞的IB分析( n个 =3，平均值±SD，ns表示无显著性，成对 t吨 ‐测试）。
A–C TRIM21增强了IFN‐α和IFN∙β的表达。 将TRIM21转染到HEK293T细胞中48小时，然后用羟基脲（HU）处理指定的时间点。 （A） SAMHD1的IB分析。 HU治疗后IFN-α（B）和IFN-β（C）mRNA水平( n个 =3，平均值±SD* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01，成对 t吨 ‐测试）。 D–F 增加SAMHD1可减少TRIM21诱导的IFN‐α和IFN‐）βmRNA的增加。HEK293T细胞与TRIM21 WT或C16A突变体共转染，并增加SAMHT1的剂量48小时，然后用HU处理4小时。 细胞进行IB分析（D），以GAPDH为对照，采用RT-qPCR检测IFN‐α（E）和IFN∙β（F）mRNA水平( n个 =3，平均值±SD）。 G–I型 TRIM21以SAMHD1依赖的方式增强IFN-α和IFN-β的产生。 将TRIM21转染pLKO.1或sh‐SAMHD1 HEK293T细胞48 h，然后用HU处理细胞4 h。 细胞进行IB分析（G），以GAPDH为对照，采用RT-qPCR检测IFN‐α（H）和IFN∙β（I）mRNA水平( n个 =3，平均值±SD** P（P） < 0.01，成对 t吨 ‐测试）。
A–C TRIM21通过PRY和SPRY域与SAMHD1交互。 （A） TRIM21 WT和突变体示意图。 （B） TRIM21对SAMHD1降解的影响。 将SAMHD1‐flag与VR1012、TRIM21 WT或所示突变体共同转染到HEK293T细胞中48 h，并以微管蛋白作为负荷对照对细胞进行IB。 （C） SAMHD1‐flag与VR1012或TRIM21 WT或指示突变体共转染24 h，然后在收获前用10μM MG132处理细胞12 h，并进行HA IP和IB处理。 D类 SAMHD1 WT和截断突变体的图谱。 E类 TRIM21对SAMHD1 WT或其突变体的影响。 将SAMHD1‐HA或所示突变体与VR1012或TRIM21‐flag共转染到HEK293T细胞中48 h，并以微管蛋白作为负荷对照对细胞进行IB。 F类 SAMHD1‐flag 1–547与VR1012或TRIM21‐HA共转染24 h，然后在收获前用10μM MG132处理细胞12 h，并进行HA IP和IB处理。 G公司 在Rosetta（DE3）中表达SAMHD1 109–626后接His标记或TRIM21‐PRYSPRY后接GST标记，并分别用Ni-Sepharose（向上）和GST-Sepharose（向下）进行下拉分析。 H（H） FRET分析表明YFP‐SAMHD1和CFP‐TRIM21之间的相互作用。 受体荧光团YFP光漂白前后SAMHD1-YFP（黄色）和ECFP-TRIM21（青色）表达细胞的代表性图像。 选择用于光漂白的区域标记为（白色开盒），条形，10μm。 荧光亮度的量化通过ImageJ进行分析( n个 =3，平均值±SD，ns表示无显著性* P（P） < 0.05，成对 t吨 测试）。 我 SAMHD1和TRIM21之间相互作用的微尺度热泳曲线。 Alexa Fluor公司 ® 将浓度为20 nM的647标记SAMHD1与未标记TRIM21的两倍稀释系列（3μM至9.16E‐05μM）孵育。 曲线表示三次测量记录的信号。 根据TRIM21的浓度绘制归一化荧光热泳信号，平均值±标准偏差，并拟合1:1结合模型（NanoTemper ® 分析软件，F范数=F 热门 /F类 寒冷 ). 这个 K（K） d日 这种相互作用的测定值为270±92 nM。 这些数据是使用不同稀释度的三个独立实验的代表。
TRIM21对不同物种SAMHD1蛋白的影响。 用VR1012或TRIM21和指示的SAMHD1表达载体转染HEK293T细胞，然后进行IB分析。 仅在SAMHD1中出现的氨基酸的鉴定 犬科动物 和 加卢斯 但其他SAMHD1蛋白中没有。 氨基酸改变的hSAMHD1突变体的构建。 TRIM21对hSAMHD1突变体的影响。 将VR1012或TRIM21和SAMHD1突变体转染HEK293T细胞48 h，然后进行IB分析。 SAMHD1‐flag WT或G153S或G183R突变体与VR1012或TRIM21‐HA共转染24 h，然后在收获前用10μM MG132处理细胞12 h，并进行HA IP和IB处理。 SAMHD1上潜在泛素化位点示意图。 将SAMHD1‐HA WT或所示突变体与VR1012或TRIM21‐flag共同转染到HEK293T细胞中48 h，并以微管蛋白作为负荷对照对细胞进行IB。 SAMHD1‐HA WT和VR1012或TRIM21与K48‐only和K63‐only-ubiquitin‐flag共同转染到HEK293T细胞中24 h，然后在收获前用10μM MG132处理细胞12 h，并以微管蛋白为负荷控制进行HA IP和IB。 如图所示，仅K48‐泛素标记物和SAMHD1‐HA WT或突变K622R与VR1012或TRIM21共同转染到HEK293T细胞中。 然后，在收获前用10μM MG132处理细胞12 h，并用微管蛋白进行HA IP和IB负载控制。 将VR1012、SAMHD1-HA WT或K622R突变体转染到HEK293T‐shSAMHD1细胞中24小时。 然后以0.1的MOI感染EV71细胞，并在指定的时间点收获。 IB以微管蛋白作为负荷对照，检测SAMHD1-HA、TRIM21和EV71-VP1。
A类 将稳定的sh‐SAMHD1 HEK293T细胞转染VR1012、SAMHD1-WT或所示突变体24小时，然后以0.05的MOI感染EV71 72小时。 收集细胞并进行IB分析。 B类 RD和HEK293T细胞中T592‐磷酸化SAMHD1和总SAMHD1的IB分析。 C类 TRIM21对内源性磷酸化SAMHD1和总SAMHD1.的影响。 D类 TRIM21对异位磷酸化和非磷酸化SAMHD1的影响。 E、 F类 TRIM21直接诱导SAMHD1降解，但不通过改变细胞周期或上调细胞周期蛋白L2表达。 （E） TRIM21对MDM中的G0-G1转变没有影响。 （F） TRIM21对MDM中细胞周期蛋白L2的表达没有影响。
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