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.2020年1月10日；48(1):96-115.
doi:10.1093/nar/gkz1051。

PRMT1介导的微处理器相关蛋白甲基化调节微小RNA的生物发生

瓦莱里娅·斯帕多托 1, 罗伯托·吉安布鲁诺 1, 恩里科·马西格纳尼 1, 玛丽亚·米哈伊洛维奇 1, 玛丽安娜·马尼亚奇 1, 弗朗西丝卡·帕图佐 1, 弗朗西斯科·吉尼 2, 弗朗西斯科·尼卡西奥 2, 蒂齐亚娜·博纳尔迪 1
附属机构

PRMT1介导的微处理器相关蛋白甲基化调节微RNA的生物发生

瓦莱里娅·斯帕多托等。 核酸研究. .

摘要

微RNA（MicroRNA）的生物生成是一个由微处理器及其相关蛋白的活性在细胞核内操作的严格控制的多步骤过程。通过高分辨率质谱（MS）-蛋白质组学，我们发现该复合物被广泛甲基化，其24个亚基中的19个亚基有84个甲基化位点。大多数修饰发生在精氨酸（R）残基上（61），导致81次甲基化事件，而30次赖氨酸（K）甲基化事件发生在复合物的23个位点上。有趣的是，I型蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）的耗竭和药物抑制导致复合物甲基化状态的广泛变化，并导致miRNA表达的整体下降，这是pri-to-re-miRNA处理步骤受损的结果。特别是，我们表明微处理器亚单位ILF3甲基化程度降低与其与前miRNAs miR-15a/16、miR-17-92、miR-301a和miR-331结合程度降低有关。我们的研究揭示了R-甲基化在哺乳动物细胞中调节miRNA生物生成中以前未被证实的作用。

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数字

图1。
图1。
用MS表征LDC甲基化模式(A类)用于描述LDC甲基蛋白组的hmSILAC/co-IP方法的工作流。甲基化程度可以根据轻肽和重肽之间的质量差异来确定（4 Da=单甲基化，8 Da=二甲基化，12 Da=三甲基化）。(B类)用胰蛋白酶消化的免疫沉淀物质凝胶中考马斯染色凝胶，并用LC-MS/MS分析；虚线对应于处理和MS分析的单个凝胶切片。Mk=蛋白质分子标记。(C类)通过WB分析验证用作诱饵的四种LDC蛋白的IP效率。免疫球蛋白G（IgG）IP作为阴性对照。FT=IP流量。预清除=IP前与细胞提取物孵育时结合磁珠的非特定蛋白质。(D类)使用Cytoscape和甲基化LDC蛋白的LDC复合物的图示以绿色显示，非甲基化LDC蛋白以灰色显示；蓝色圆圈表示含有新注释的甲基侧的蛋白质。(E类)注释的LDC甲基蛋白组的摘要，与之前发布的摘要相比（30）。甲基肽：含有一个或多个甲基化事件的已识别肽的数量；修改：hmSILAC/co-IP鉴定的K和R残基上发生的单、二和三甲基化事件总数；地点：甲基化残基数量；LDC甲基化蛋白质：hmSILAC/co-IP发现甲基化的LDC蛋白数量。(F类)LDC上所有精氨酸（R）和赖氨酸（K）甲基化的总结。报告已识别修改的数量和相应的百分比。(G公司)左上面板：通过hmSILAC/蛋白IP识别的单甲基和双甲基精氨酸摘要。上面板中部：确定为单甲基或双甲基的R位点的维恩图。右上面板：二甲基肽的维恩图一对称地d日我-米乙基化的一精氨酸（ADMA）或秒对称地d日我-米乙基化的一精氨酸（SDMA）。左下面板：hmSILAC/co-IP鉴定的单甲基、二甲基和三甲基赖氨酸概要。右下面板：确定为单甲基、二甲基和三甲基的K位点的维恩图。报告已识别修改的数量和相应的百分比。(H（H）)根据SMART域数据库（113）确定的R-甲基侧（上面板）和K-甲基侧的定位分析。报告已识别修改的数量和相应的百分比。
图2。
图2。
PRMT1下调在全球范围内损害成熟miRNA的表达。(A类)利用TaqMan阵列人类miRNA卡对PRMT1 sh-1缺失PRMT1后的miRNA全球表达分析。数据显示为日志2折叠改变，并根据一组管家基因（mammU6、RNU44、RNU46、U6snRNA）的几何平均值进行标准化。直方图表示在2个技术重复中定量的miRNA的平均值±SEM。当其折叠变化大于/小于1.5时，受调控的miRNA被认为是显著的。(B类)热图显示日志2sh-1和sh-2 shRNA构建物实现了对照组（EV）和PRMT1 KD中miRNA的折叠变化。数据通过小核仁RNA进行标准化。每个样品的平均技术重复次数为2次。(C类)miRNA和小核仁RNA（snoRNA）原始计数的分布框，以及miRNA相对于snoRNA计数的归一化框。采用非参数Wilcoxon检验进行统计分析。(D类)Box-plot显示了从miRiad（114）获得的PRMT1 KD上基因内和基因间miRNA的分布。分析中只考虑了指导性miRNAs。
图3。
图3。
PRMT1缺失后，初级对递归miRNAs的处理受损。(A类)用于选择性检测前、前和成熟miRNA的qPCR引物的示意图。箭头表示用于通过qPCR扩增每个miRNA亚型的引物的结合区域。灰色矩形表示Qiagen通用反向引物的结合区域（用黑色箭头表示），根据供应商的协议，该引物用于扩增预成熟和成熟miRNA的相同3′端区域。(B类)使用HeLa细胞中的sh-1和sh-2结构对PRMT1 KD进行miR-15a/16、miR-17-92、miR-301a和miR-331的pri-miRNA的qPCR分析。感染后72小时进行分析。直方图表示对数的平均值±SEM23个生物实验中PRMT1缺失细胞与EV对照细胞的倍数变化（n=3）。使用单样本T检验进行统计分析。*=具有的值P（P）-值<0.05。(C类)对HeLa细胞中含有sh-1和sh-2的PRMT1 KD上起源于miR-15a/16、miR-17-92、miR-301a和miR-331的前miRNAs进行qPCR分析。感染后72小时进行分析。直方图表示对数的平均值±SEM2sh-1四个生物复制品的平均值与EV控制细胞的倍数变化(n个=4，上部面板）和sh-2的三个生物复制品(n个=3，下部面板）。使用一个样本进行统计分析t吨-测试。*=具有的值P（P）-值<0.05.**=具有的值P（P）-值≤0.01且***=值P（P）-值≤0.001。(D类)对HeLa细胞中含有sh-1和sh-2的PRMT1 KD上来源于miR-15a/16和miR-17-92簇以及miR-301a-5p、miR-301a-3p和miR-331的成熟miRNAs进行qPCR分析。在感染后72小时进行分析。直方图表示对数的平均值±SEM2电动汽车控制单元上KD的折叠变化。结果是sh-1的四个生物重复的平均值(n个=4，上部面板）和3个生物复制品，用于sh-2(n个＝3，下面板）。使用一个样本进行统计分析t吨-测试。*=具有的值P（P）-值<0.05.**=具有的值P（P）-值≤0.01且***=值P（P）-值≤0.001。
图4。
图4。
PRMT1不改变LDC的表达和组成，但调节LDC甲基化。(A类)针对PRMT1调制后LDC表达和组成的蛋白质组学分析而设计的实验装置的工作流程。使用1:1混合的SILAC标记的HeLa细胞的核提取物，耗尽或过度表达PRMT1（KD、sh-1和PRMT1 OE），或感染EV（对照），对LDC进行Co-IP。在三个独立的生物复制品中对带有单个诱饵的复合物进行每次免疫增强(n个=3），SILAC通道交换（正向和反向实验）。(B类)LDC表达分析：HeLa细胞SILAC核输入中识别和定量的所有蛋白质的散点图，PRMT1缺失或未缺失。散点图显示日志2正向（Fwd）和反向（Rev）实验中定量蛋白质的SILAC分布（正向（Fwd）实验的H/L比率和反向（Rev）实验的L/H比率）。PRMT1对应的点以蓝色突出显示；LDC亚单位显示为橙色，其余所有蛋白质显示为灰色。虚线表示从Fwd和Rev实验中的整个肽SILAC比率分布计算得出的μ±2б截止值，它将显著的异常值从不变的总体中分离出来。(C类)LDC蛋白质组成分析：DGCR8 co-IP中识别和量化的所有蛋白质的散点图，按B所述进行分析；DGCR8对应的点显示为蓝色；所有LDC蛋白质以橙色表示，其余蛋白质以灰色表示。虚线表示根据蛋白质比率分布计算的μ±2б截止值，并定义了与不变蛋白质的显著变化。(D类)热图显示在SILAC/co-IP实验中对PRMT1 KD和PRMT1 OE进行鉴定和量化的甲基化肽的无监督聚类分析。分析中仅包括在至少两个PRMT1 KD或PRMT1 OE的co-IP实验中确定的肽。数据显示为每个诱饵的三个独立IP的平均值，并表示为对数2与对照细胞相比，PRMT1 KD/OE细胞的比率。热图显示了使用皮尔逊相关性和数据平均分析生成的数据的无监督聚类。显示每个甲基肽的甲基化类型（me=单甲基化；di=双甲基化；tr=三甲基化）以及相应的甲基侧。识别出的2个主簇用不同的颜色代码表示（簇A为红色，簇B为蓝色）。*=根据每个IP实验的未修饰肽分布计算出的μ±1б截止值，甲基化肽在SILAC实验中显著调节。(E类)使用ScanX软件对所有SILAC定量甲基肽进行Motif富集分析（115）。设置了以下参数：R中心字符；宽度=7；出现次数=10；显著性=0.000001（右侧面板）。对A组和B组中分别鉴定出的甲基肽也进行了相同的分析（右侧面板）。(F类)SILAC/co-IP实验中确定的蛋白质的LDC复合物与细胞景观的表示：发现甲基化的蛋白质以绿色显示。甲基化蛋白，其甲基化状态在PRMT1调节时显著改变，用橙色圆圈突出显示。非甲基化蛋白质以灰色显示。(G公司)从经DMSO、MS023抑制剂和MS094对照化合物处理的HeLa细胞中免疫富集ILF3和TAF15，在10μM浓度下使用16 h。WB分析使用抗ADMA、抗ILF3及抗TAF15分别评估二甲基化水平及未修饰的ILF3与TAF15蛋白水平。
图5。
图5。
PRMT1的药理学抑制抑制pri-miRNA前处理步骤，并影响ILF3与pri-miRNA靶点的相互作用。(A类)用MS023和MS094（10μM）处理HeLa细胞后，对miR-15a/16和miR-17-92簇以及miR-301a和miR-331转录物中的前、前和成熟miRNA进行qPCR分析。直方图表示MS023在MS094处理细胞上的折叠变化的平均±SEM，这是根据前、前和成熟miR-15a/16的五个生物复制品计算得出的(n个=5）和其他显示的前、前和成熟miRNA的四个生物复制(n个= 4). 使用一个样本进行统计分析t吨-测试。*=具有的值P（P）-值<0.05.**=具有的值P（P）-值≤0.01。虚线设置为1，这是MS023和MS094处理细胞中转录物表达相等的理论水平。(B类)表达空载体（EV）或PRMT1（sh-1）特异性shRNA的HeLa细胞中ILF3和DGCR8的UV-RIP。IgG被用作IP的模拟控制。显示的数据是4个生物复制实验的平均值(n个=4），并表示为输入的比率，因此表示褶皱富集。带有pri-miR-15a/16和pri-miR-17-92的ILF3的UV-RIP显示在上部条形图中；而带有pri-miR-301a和pri-miR331的则位于底部条形图中。使用非参数双尾数据进行统计分析t吨-测试。*=具有显著性的值P（P）值<0.05。(C类)强力霉素给药后在HeLa细胞中表达的HA-ILF3野生型、HA-ILF3R609A和HA-ILF3-R609K突变体的UV-RIP。带有pri-miR-15a/16和pri-miR-17-92的HA标记蛋白的UV-RIP显示在上部条形图中，而带有pri-miR-301a和pri-miR-331的UV-RIP显示在底部条形图中。显示的数据是三个生物复制实验的平均值(n个=3），pri-miR-301a除外(n个=2），和表示为输入的比值，因此表示褶皱富集。使用非参数双尾模型进行统计分析t吨-测试。*=具有显著性的值P（P）值<0.05.**=具有的值P（P）-值≤0.01。(D类)PRMT1通过微处理器相关蛋白的甲基化在miRNA生物发生中的调节作用模型。
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