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.2020年1月;45(1):103-114.
doi:10.3892/ijmm.2019.4395。 Epub 2019年11月4日。

Margatoxin通过巨噬细胞极化、细胞因子分泌和STAT信号减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化

附属公司

Margatoxin通过巨噬细胞极化、细胞因子分泌和STAT信号减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化

吴宝明等。 国际分子医学杂志. 2020年1月.

摘要

许多巨噬细胞表型先前被确定为肝纤维化(HF)进展的关键调节因子。巨噬细胞或Kupffer细胞(KCs)的细胞因子也被确定为HF的重要调节因子。在HF模型中阻断Kv1.3、调节巨噬细胞极化和细胞因子分泌尚未被评估为该疾病的潜在治疗方案。在目前的研究中,建立了四氯化碳(CCl4)诱导的HF模型,并检测了margatoxin(MgTX;Kv1.3的抑制剂)对HF的影响。进行了苏木精和伊红、Masson三色染色和免疫组织化学染色,以确定MgTX是否能缓解肝纤维化。为了阐明MgTX减轻肝损伤的机制,采用逆转录定量PCR和western blot分析检测RAW264.7细胞中的极化巨噬细胞标记物,并用ELISA检测细胞因子。此外,在RAW264.7细胞中发现了与巨噬细胞极化相关的巨噬细胞极化信号转导子和转录激活子(STAT)信号。结果表明,MgTX保护小鼠免受CCl4诱导的肝纤维化。此外,MgTX降低了CCl4诱导的HF中M1表型生物标志物的表达,增加了M2表型生物标记物的表达。此外,注射MgTX的HF小鼠血清中促炎细胞因子的生成减少,白细胞介素-10的生成增加。此外,发现MgTX通过抑制p‑STAT1活性调节M1标记的表达,并通过促进p‑TAT6活性增加M2标记的表示。总的来说,本研究的结果表明,MgTX能够缓解CCl4诱导的小鼠HF,可能通过巨噬细胞极化、细胞因子分泌和STAT信号传导。

关键词:肝纤维化;马加毒素;巨噬细胞极化;细胞因子。

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数字

图1
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MgTX(0.4179 mg/kg)改善CCl4诱导的C57BL/6J小鼠HF。(A) 肝组织的代表性苏木精和伊红染色、马森染色和天狼星红染色显示肝小叶结构不完整,肝板排列不规则。与经MgTX治疗的HF模型组相比,发现肝组织出现散在变性、坏死和大量炎性细胞浸润(放大倍率,×200;黑色箭头表示纤维化;绿色箭头表示脂肪变性;红色箭头表示炎性细胞渗透)。(B) 肝纤维化组织的免疫组织化学和(C)western blot分析显示,与CCl4暴露组相比,经MgTX治疗的肝纤维化组织α-SMA和I型胶原表达增加。*P<0.05,***与CCl4相比,P<0.001;#P<0.05,###与阴性对照组相比,P<0.001。展示了每组的代表性视图(原始放大倍数,×20;n=6)。MgTX,马加毒素;CCl4,四氯化碳;HF,肝纤维化。
图1
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MgTX(0.4179 mg/kg)改善CCl4诱导的C57BL/6J小鼠HF。(A) 肝组织的代表性苏木精和伊红染色、马森染色和天狼星红染色显示肝小叶结构不完整,肝板排列不规则。与经MgTX治疗的HF模型组相比,发现肝组织出现散在变性、坏死和大量炎性细胞浸润(放大倍率,×200;黑色箭头表示纤维化;绿色箭头表示脂肪变性;红色箭头表示炎性细胞渗透)。(B) 肝纤维化组织的免疫组织化学和(C)western blot分析显示,与CCl4暴露组相比,经MgTX治疗的肝纤维化组织α-SMA和I型胶原表达增加。*P<0.05,***与CCl4相比,P<0.001;#P<0.05,###与阴性对照组相比,P<0.001。展示了每组的代表性视图(原始放大倍数,×20;n=6)。MgTX、margatoxin;CCl4,四氯化碳;HF,肝纤维化。
图1
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MgTX(0.4179 mg/kg)改善CCl4诱导的C57BL/6J小鼠HF。(A) 肝组织的代表性苏木精和伊红染色、马森染色和天狼星红染色显示肝小叶结构不完整,肝板排列不规则。与经MgTX治疗的HF模型组相比,发现肝组织出现散在变性、坏死和大量炎性细胞浸润(放大倍率,×200;黑色箭头表示纤维化;绿色箭头表示脂肪变性;红色箭头表示炎性细胞渗透)。(B) 肝纤维化组织的免疫组织化学和(C)western blot分析显示,与CCl4暴露组相比,经MgTX治疗的肝纤维化组织α-SMA和I型胶原表达增加。*P<0.05,***与CCl4相比,P<0.001;#P<0.05,###与阴性对照组相比,P<0.001。展示了每组的代表性视图(原始放大倍数,×20;n=6)。MgTX,马加毒素;CCl4,四氯化碳;HF,肝纤维化。
图2
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MgTX(0.4179 mg/kg)降低CCl4诱导的HF(×200场)C57BL/6J小鼠HF相关蛋白的表达。(A) MMP12、MM13和POSTN与ECM和胶原蛋白的含量相关。肝纤维化组织的免疫组织化学显示,与MgTX治疗的HF组相比,MMP12、MM13和POSTN的染色增强。*CCl4组与CCl4+MgTX组相比P<0.05;#CCl4组与N组相比,P<0.05。(B) CCL2、Kv1.3和δ-catenin与巨噬细胞的迁移有关。肝纤维化组织的免疫组织化学显示,与用MgTX治疗的HF组相比,CCL2和Kv1.3的染色增加。*CCL4组与CCL4+MgTX组相比P<0.05;#CCL4组与N组相比,P<0.05。n=6。MgTX,马加毒素;HF、肝纤维化;CCl4,四氯化碳;CCL2,C-C基序趋化因子配体2;基质金属蛋白酶;POSTN,骨膜炎素;ECM,细胞外基质。
图2
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MgTX(0.4179 mg/kg)降低CCl4诱导的HF(×200场)C57BL/6J小鼠HF相关蛋白的表达。(A) MMP12、MM13和POSTN与ECM和胶原蛋白的含量相关。肝纤维化组织的免疫组织化学显示,与MgTX治疗的HF组相比,MMP12、MM13和POSTN的染色增强。*CCl4组与CCl4+MgTX组比较,P<0.05;#CCl4组与N组相比,P<0.05。(B) CCL2、Kv1.3和δ-catenin与巨噬细胞的迁移有关。肝纤维化组织的免疫组织化学显示,与用MgTX治疗的HF组相比,CCL2和Kv1.3的染色增加。*CCL4与CCL4+MgTX组比较,P<0.05;#CCL4组与N组相比,P<0.05。n=6。MgTX,马加毒素;HF、肝纤维化;CCl4,四氯化碳;CCL2,C-C基序趋化因子配体2;基质金属蛋白酶;POSTN,骨膜炎素;ECM,细胞外基质。
图3
图3
MgTX降低RAW264.7细胞中HF相关蛋白的表达。为了证实RAW264.7细胞中HF相关蛋白的免疫组织化学结果,(A)进行了western blot分析,以检测MMP12、MM13、POSTN、CCL2、Kv1.3和δ-catenin的表达,这些蛋白在M1表型组中被MgTX下调。(B-G)在M2表型组中,MMP12、MM13、CCL2和Kv1.3被MgTX上调;然而,M2表型组的POSTN和δ-catenin被MgTX下调。对照组(N)和MgTX组之间未观察到显著差异。*与M1组相比P<0.05;#与M2组相比,P<0.05。n=3。MgTX,马加毒素;HF、肝纤维化;基质金属蛋白酶;POSTN,骨膜炎素;CCL2,C-C基序趋化因子配体2。
图4
图4
MgTX调节细胞因子分泌体内.通过腹腔注射将3种不同浓度的MgTX注射到小鼠体内。用ELISA试剂盒检测小鼠血清中的细胞因子,MgTX(H):0.41 mg/Kg,MgTX-(M):0.14 mg/Kg和MgTX--(L):0.04 mg/Kg.(A-F)ELISA检测小鼠血清促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-20)的水平。与HF模型组相比,IL-10的细胞因子水平受到抑制,而与经MgTX治疗的HF模型对照组相比,这些水平升高。TGF-β组(n=6)的细胞因子水平在模型组中升高,而在用MgTX治疗的HF模型组中没有观察到显著差异。*与对照组相比P<0.05;#与模型组相比,P<0.05。n=6。MgTX、margatoxin;肿瘤坏死因子-α;IL、白细胞介素;转化生长因子-β;HF,肝纤维化。
图5
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MgTX调节巨噬细胞极化在体外采用逆转录定量PCR和western blot分析检测RAW264.7细胞中M1和M2标记的表达。MgTX下调M1表型巨噬细胞iNOS、CCL2、TNF-α和IL-1β(A-H)mRNA表达水平。与M2表型巨噬细胞相比,经MgTX处理的M2表型的巨噬细胞IL-10、CD163、Arg-1、MAC-2的mRNA表达水平上调。western blot分析检测M1标记物(iNOS、CCL2、TNF-α和IL-1β)的(I-Q)蛋白表达水平和M2标记物的蛋白表达水平(IL-10、CD163、Arg-1、Mrc2)。*P<0.05,**P<0.01,M1组对M1+MgTX组,M2组对M2+MgTX组。对照组(N),N=3。MgTX,马加毒素;CCL2,C-C基序趋化因子配体2;肿瘤坏死因子-α;IL、白细胞介素;CD,分化簇。
图5
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MgTX调节巨噬细胞极化在体外采用逆转录定量PCR和western blot分析检测RAW264.7细胞中M1和M2标记的表达。MgTX下调M1表型巨噬细胞iNOS、CCL2、TNF-α和IL-1β(A-H)mRNA表达水平。与M2表型巨噬细胞相比,经MgTX处理的M2表型的巨噬细胞IL-10、CD163、Arg-1、MAC-2的mRNA表达水平上调。western blot分析检测M1标记物(iNOS、CCL2、TNF-α和IL-1β)的(I-Q)蛋白表达水平和M2标记物的蛋白表达水平(IL-10、CD163、Arg-1、Mrc2)。*P<0.05,**P<0.01,M1组对M1+MgTX组,M2组对M2+MgTX组。对照组(N),N=3。MgTX,马加毒素;CCL2,C-C基序趋化因子配体2;肿瘤坏死因子-α;IL、白细胞介素;CD,分化簇。
图6
图6
MgTX通过STAT1/STAT6途径调节巨噬细胞极化。分别对M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞给予MgTX,并用western blot分析测定磷酸化STAT1/STAT6的表达。(A-C)数据表示为未经处理的相对蛋白质表达与对照表达。与对照组相比,M1/M2表型巨噬细胞中STAT1/STAT6的磷酸化水平显著升高,经MgTX处理的M1表型巨噬细胞中p-STAT1表达下调。*与M1组相比P<0.05;##与对照组相比P<0.01(N)。p-STAT6在用MgTX处理的M2表型巨噬细胞中上调。**与M2组相比P<0.05;#与对照组相比,P<0.05。n=3。MgTX、margatoxin。

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