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.2020年1月16日；77（2）：228-240.e7。
doi:10.1016/j.molcel.2019.10.016。 Epub 2019年11月13日。

mTORC1-CDK1开关在有丝分裂过程中维持自噬抑制

理查德·奥德 1, 西蒙·沃克 2, 大卫·奥克斯利 三, 安德鲁·基德 4, 凯瑟琳·巴尔曼诺 4, 丽贝卡·吉莉 4, Hanneke Okkenhaug公司 2, 奥利弗·弗洛里 4, 尼古拉斯·蒂斯塔基斯 4, 西蒙·库克 5
附属公司

mTORC1-CDK1开关在有丝分裂过程中维持自噬抑制

理查德·奥德等人。 分子电池. .

摘要

由于后生动物细胞在有丝分裂过程中发生核膜破裂，有人提出必须抑制巨自噬以保持基因组的完整性。然而，在有丝分裂过程中对大细胞自噬的抑制仍然存在争议，机制细节仅限于CDK1磷酸化VPS34的建议。这里，我们表明，即使mTORC1被抑制，在有丝分裂期间，通过ULK复合体向自噬点的易位来衡量的大自噬的启动也受到抑制。事实上，mTORC1在有丝分裂期间是不活跃的，这反映了由于CDK1依赖性RAPTOR磷酸化，它未能定位于溶酶体。虽然mTORC1通常通过ULK1、ATG13、ATG14和TFEB的磷酸化来抑制自噬，但我们发现这些自噬调节器的有丝分裂磷酸化，包括已知的抑制位点，依赖于CDK1，但与mTOR无关。因此，CDK1替代受抑制的mTORC1，作为有丝分裂期间大自噬的主调节器，将自噬调节与营养状态解耦，以确保有丝分裂过程中大自吞噬的抑制。

关键词：ATG13；ATG14；CDK1；猛禽；TFEB；ULK1；自噬；mTOR；有丝分裂。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

无
图形摘要
图1
图1
与间期细胞相比，p-S10 H3阳性有丝分裂细胞中的ATG13点刺显著减少（A）从双胸腺嘧啶核苷阻断释放10 h的HeLa细胞用1μM AZD8055或饥饿（HBSS+1%BSA）处理2 h。使用的主要抗体为ATG13（绿色）和p-S10 h 3（品红色）。（B） 量化（A），显示不同条件下每个细胞ATG13点的平均数量。三次生物复制的平均值±标准差。通过双向方差分析（Tukey）计算p值。∗p＜0.05；∗∗p<0.01；∗∗∗p<0.001。（C） 视频S2中的蒙太奇。HEK293 GFP-ATG13（绿色）H2B-mCherry（品红色）细胞在转移到活细胞成像培养箱之前用1μM AZD8055处理1 h。有丝分裂细胞用箭头表示。（D） 用1μM AZD8055或饥饿（HBSS）处理MRC5细胞2 h。使用的主要抗体为ATG13（绿色）和p-S10 H3（品红）。（E） 量化（图S1C），显示不同条件下每个细胞WIPI2点的平均数量。三个生物重复的平均值±SD。通过双向方差分析（Tukey）计算的p值。∗p<0.05；∗∗p<0.01。比例尺，20μm。
图2
图2
mTORC1在有丝分裂期间未能定位到溶酶体（A）用1μM AZD8055处理异步HeLa细胞2小时。使用的主要抗体为Lamp2（洋红色）和mTOR（绿色）。（B） HAP1 RAPTOR-GFP细胞用AZD8055（1μM）处理、饥饿或饥饿，然后再重复5分钟。使用的主要抗体是LAMP2（品红色）。DAPI通道中显示有丝分裂细胞（M）。（C） 对异步HeLa细胞进行RagC（绿色）和Lamp2（洋红色）免疫染色。（D） 异步HeLa细胞转染WT-Rag双链或活性Rag双链。转染细胞在合并图像中用X表示（基于HA免疫染色）。（E） 在用GFP-TRAP进行免疫沉淀之前，用50 nM紫杉醇（16 h）、1μM AZD8055（2 h）或饥饿处理HAP1 RAPTOR-GFP细胞。HAP1亲代细胞（P）作为阴性对照（P）。（F） 在用GFP-TRAP进行免疫沉淀之前，用50 nM紫杉醇（16 h）、2μM RO-3306（2 h）或饥饿处理HAP1 RAPTOR-GFP细胞。（G） 在用HA抗体进行免疫沉淀之前，用50 nM紫杉醇（16 h）处理稳定表达指示HA-RAPTOR结构的HeLa细胞。Western blot来自三个独立实验的代表性单个实验。比例尺，20μm。
图3
图3
用微管抑制剂以CDK1依赖方式治疗后，观察到自噬调节因子（ATG13、ATG14、TFEB和ULK1）的过度磷酸化（a）HCT116细胞用50 nM紫杉醇治疗指定时间。（B） HeLa细胞用50 nM紫杉醇（16 h）或DMSO对照处理。然后免疫沉淀ATG13并用λPP处理。（C） 除TFEB是从COLO205细胞免疫沉淀外，实验按（B）进行。（D） 用50 nM紫杉醇或二甲基亚砜对照物和在λPP存在或不存在的情况下培养的全细胞裂解物处理HCT116细胞。（E） 用50 nM紫杉醇（16 h）处理HCT116细胞，并在最后2 h内添加指定剂量的RO-3306−1诺可达唑（16小时），并在裂解前2小时接受二甲基亚砜、2μM RO-3306、10μM NU6102或25μM roscovitine。Western印迹来自代表三个独立实验的单个实验。
图4
图4
自噬调节因子的有丝分裂磷酸化独立于mTOR（A）HCT116细胞，用50 nM紫杉醇处理16 h，并在裂解前2 h接受DMSO、2μM RO-3306、1μM曲美替尼或1μM AZD8055。（B） HCT116细胞用50 nM紫杉醇处理（16 h），并在裂解前2 h接受DMSO、1μM AZD8055、250 nM Torin-1或1μM PP242。（C） 用50 nM紫杉醇处理HCT116细胞6小时，直到大约一半的细胞变圆（表明有丝分裂）。在裂解前2小时，用二甲基亚砜或AZD8055（1μM）处理细胞。烧瓶随后进行有丝分裂振荡，以丰富间期（I；粘附）和有丝分裂（M；分离）细胞。（D） 对稳定表达WT-TFEB-GFP或Δ30-TFEB-GFP的HeLa细胞进行如下处理：饥饿（2 h）、再喂养（完全培养基；1 h）、50 nM紫杉醇（16 h）或1μM AZD8055（2小时）。Western blot来自三个独立实验的代表性单个实验。
图5
图5
在无微管毒物的情况下同步有丝分裂时观察到自噬调节器的有丝分裂磷酸化。（A）HT-29细胞在释放到无药培养基中之前，用9μM RO-3306处理20 h，在不含或含有1μM AZD8055的情况下释放到指定时间。作为阳性对照，用50 nM紫杉醇处理HT-29细胞16 h（P）。（B） HeLa细胞从双胸苷块中释放10 h，在最后2 h内接受DMSO或1μM AZD8055。间期（I；粘附）和有丝分裂（M；分离）细胞通过有丝分裂振荡富集。（C）A549或HCT116细胞在固定前2 h用DMSO和1μM阿奇德8055处理，对p-H3（S10）或p-ULK1（S758）进行染色，流式细胞仪分析。显示了不同p-H3（S10）亚群的平均p-ULK1（S758）强度。使用双向方差分析（Tukey）计算p值。∗p<0.05；∗∗p<0.01。直方图显示了单个实验中具有代表性的种群。（D） 用50 nM紫杉醇（16 h）、1μM AZD8055（2 h）或饥饿（2 h。显示了p-H3（S10）阳性和阴性亚群的平均p-ULK1（S758）强度。使用双向方差分析（Tukey）计算的p值。∗p<0.05；∗∗p<0.01。源图像示例如图S6C所示。Western blot来自三个独立实验的代表性单个实验。
图6
图6
使用GST标记的蛋白片段作为底物和[γ-32P] 含或不含300 nM RO-3306或500 nM NU6102的ATP(∗免疫沉淀重链抗体）。（B） 用300 nM RO-3306处理活性CCNB1-CDK1，并使用GST-TFEB（76-160）作为底物进行“冷”CDK1激酶分析，并用指示的抗体进行探测。（C） 用50 nM紫杉醇（16 h）和/或1μM AZD8055（2 h）处理HeLa WT-TFEB-GFP细胞。显示输入裂解物和抗GFP免疫沉淀物；注意，检测特异性p-S122 TFEB信号需要免疫沉淀蛋白（Vega-Rubin-de-Celis等人，2017年）。（D） 来自视频S4的蒙太奇。异步HeLa TFEB-GFP H2B mCherry用1μM AZD8055处理1小时，然后转移到活细胞成像培养箱中。（E） 用50nM紫杉醇（16小时）和/或1μM AZD8055（2小时）处理HAP1细胞。（F） 提供了荧光Li-C或western印迹（E）的定量。使用单向方差分析（Tukey）计算p值。∗p<0.05；∗∗p<0.01。Western blot和X光片来自一个实验，代表了三个独立的实验。
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中的注释

  • 有丝分裂打开了自噬控制的开关。
    威尔森·J·。 威尔森·J·。 Nat Rev Mol细胞生物学。2020年1月；21(1):4-5. doi:10.1038/s41580-019-0196-1。 Nat Rev Mol细胞生物学。2020 PMID：31758162 没有可用的摘要。
  • ULK复合物的有丝分裂磷酸化调节细胞周期进展。
    Yamasaki A、Jin Y、Ohsumi Y。 山崎A等人。 《公共科学图书馆·生物》。2020年6月9日；18（6）：e3000718。doi:10.1371/journal.pbio.3000718。eCollection 2020年6月。 《公共科学图书馆·生物》。2020 PMID：32516305 免费PMC文章。

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