Direct RNA sequencing enables m6A detection in endogenous transcript isoforms at base-specific resolution

doi:10.1261/rna.072785.119

.2020年1月；26(1):19-28.

doi:10.1261/rna.072785.119。 Epub 2019年10月17日。

直接RNA测序使m⁶在碱基特异性分辨率下检测内源性转录亚型

丹尼尔·洛伦兹^#^1 2 三, 沙申克·萨特^#^1 2 三, 杰林·爱因斯坦^1 2, 基因W Yeo^1 2 三

附属机构

¹加利福尼亚大学圣地亚哥分校细胞和分子医学系，美国加利福尼亚州拉霍亚市92093。
²干细胞项目，加利福尼亚大学圣地亚哥分校，拉荷亚，加利福尼亚92093，美国。
^三美国加州大学圣地亚哥分校基因组医学研究所，邮编：92093。

^#贡献均等。

采购管理信息： 31624092
PMCID公司： PMC6913132型
内政部： 10.1261/rna.072785.119

直接RNA测序使m⁶在碱基特异性分辨率下检测内源性转录亚型

丹尼尔·洛伦兹等。核糖核酸. 2020年1月.

.2020年1月；26(1):19-28.

doi:10.1261/rna.072785.119。 Epub 2019年10月17日。

作者

丹尼尔·洛伦兹^#^1 2 三, Shashank Sathe公司^#^1 2 三, 杰林·爱因斯坦^1 2, 基因W Yeo^1 2 三

附属机构

¹加利福尼亚大学圣地亚哥分校细胞和分子医学系，美国加利福尼亚州拉霍亚市92093。
²干细胞项目，加利福尼亚大学圣地亚哥分校，拉荷亚，加利福尼亚92093，美国。
^三美国加利福尼亚州拉霍亚加利福尼亚大学圣地亚哥分校基因组医学研究所，邮编92093。

^#贡献均等。

采购管理信息： 31624092
PMCID公司： PMC6913132型
内政部： 10.1261/rna.072785.119

摘要

直接RNA测序为以单坐标分辨率从头鉴定RNA修饰提供了很大的希望；然而，解释原始测序输出以发现修改的碱基仍然是一个挑战。利用牛津纳米孔的直接RNA测序技术，我们开发了一种随机森林分类器，该分类器使用实验检测到的N个⁶-甲基腺苷（m⁶A） DRACH图案中的位置。我们的软件MINES（m⁶使用纳米孔序列（m）进行识别⁶内源性HEK293T转录物中超过13000个先前未标记的DRACH位点的甲基化状态，并在人类乳腺上皮细胞系中鉴定出超过40000个具有异构体水平分辨率的位点。这些站点显示出对⁶作者METTL3和橡皮擦ALKBH5。矿山(https://github.com/YeoLab/MINES.git)启用m⁶直接RNA纳米孔测序的单坐标级分辨率注释。

关键词：RNA修饰；m6A；纳米孔。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
DRACH图案过滤包含了大多数m⁶A站点。(A类)基于纳米孔的测序示意图。(B类)代表性Tombo输出将单个读数描述为红线，预期值描述为灰色分布。中的黑色条*中间的*突出显示GGACT图案。热浪*在下面*每个图都显示了Tombo对每个基数的分数修改值。(C类)来自m的HEK293T和HeLa细胞位点的Motif分析⁶CLIP数据集。(D类)代表每个DRACH图案百分比的条形图（单位：m）⁶CLIP及其在非CLIP站点上的相对富集。

**图2。**
纳米孔测序可以检测内源性m⁶A(A类)直线图描绘了以GGACT中的“a”为中心的30-nt窗口中的Tombo分数修改值的平均值，该值跨越HEK293T或shRNA靶向METTL3细胞的所有位点。(B类)Tombo分数修改值在非DRACH站点的折线图。(C类)Western blot显示METTL3相对于非靶向对照的敲除。黑色箭头表示预期的METTL3分子量。(D类)米⁶用shNTC或shMETTL3处理的HEK293T细胞中poly（A）RNA的斑点杂交。亚甲基蓝的对比度调整为高亮点。(E类)ImageJ量化和标准化D类.

**图3。**
经过训练的RFM可以准确预测m⁶内置DRACH图案。(A类)方框图显示了模型预测CLIP位点的准确性，由10次训练中的每个DRACH基序组织。(B类)最终模型中GGACT图案的ROC曲线。(C类)预测AGACT、GGACA、GGACC和GGACT位点的维恩图。CLIP站点表示出于测试目的而从培训中扣留的数据。

**图4。**
矿山-预测现场模拟m⁶一个CLIP站点。(A类)由CLIP位点分解的Tombo分数修正值的线性图以及未经处理的HEK293T细胞或用靶向METTL3的shRNA处理的HEK193T细胞中GGACT的模型预测。(B类–D类)预测m的百分比⁶AGACT、GGACA、GGACC和GGACT基序中对METTL3敲除敏感的位点。

**图5。**
MINES是细胞系独立的，提供异构体水平的分辨率。(A类)GGACT HMEC中Tombo分数修正值的线图及其m⁶预测状态。(B类)预测m的百分比⁶在AGACT、GGACC、GGACT和GGACA基序中对ALKBH5过度表达敏感的位点。n个=42116（是）和71365（否）。(C类)m的元基因分析⁶HMEC中AGACT、GGACC、GGACT和GGACA基序内的A位点。(D类)条形图以基因和异构体水平的分辨率总结MINES的预测。(E类)ACTB的MINES异构体水平预测。转换为hg38坐标。

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