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.2020年1月；39（2）:469-485。
doi:10.1038/s41388-019-1035-8。 Epub 2019年10月9日。

二氯乙酸通过p53/miR-149-3p/PDK2介导的葡萄糖代谢途径恢复结直肠癌化疗敏感性

于亮 # 1, 侯立丹 # 1, 李林静（Linjing Li） 1, 李雷（Lei Li） 1, 朱黎明 1, 王宇 1, Xin Huang（新黄） 1, 侯宜超 1, 朱丹溪 1, 邹惠民 1, 阎谷 2, 翁小玲 三 4, 王莹莹 5, 岳丽 6, 吴天奇 三, 姚梦飞 三, 伊莎贝尔·格罗斯 7 8, 克里斯蒂安·盖登 9 10, 蒙罗 11, 以王建华 12, 孟向军 13
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二氯乙酸通过p53/miR-149-3p/PDK2介导的葡萄糖代谢途径恢复结直肠癌化疗敏感性

于亮等。 癌基因. 2020年1月.

摘要

化疗耐药性的发展仍然是导致结直肠癌（CRC）致死的主要挑战。二氯乙酸酯（DCA）最初用于代谢性疾病的治疗；在此，对DCA进行分析，以确定CRC化疗耐药的机制。我们发现DCA显著增强了CRC细胞对氟尿嘧啶（5-FU）的化疗敏感性，并由于高水平的凋亡减少了集落形成。使用微阵列分析，我们注意到miR-149-3p参与了大肠癌的化疗耐药性，在DCA治疗后，野生型p53对其进行了调节。此外，PDK2被确定为miR-149-3p的直接靶点。机制分析表明，miR-149-3p的过度表达增强了5-FU诱导的细胞凋亡，降低了葡萄糖代谢，与PDK2敲除的作用类似。此外，PDK2的过度表达部分逆转了miR-149-3p对葡萄糖代谢的抑制作用。最后，发现DCA治疗和5-FU耐药的CRC细胞中miR-149-3p的过度表达都能显著提高5-FU在体内的化疗效果，这种效果也在一个小的回顾性CRC患者队列中得到验证。总之，我们确定p53/miR-149-3p/PDK2信号通路可能是DCA治疗的靶点，以克服耐药CRC。

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图1
图1
DCA通过改变葡萄糖代谢恢复5-FU耐药CRC细胞的化疗敏感性。一HCT-8/F和HCT116/F细胞用15 mM和20 mM DCA，分别用于24 h.测量CRC细胞的葡萄糖消耗、乳酸生成和糖酵解。b条在15/20的实时注射中测量血糖 毫微米DCA，0.5 μM旋转 + AA和50 mM 2-DG使用Seahorse XF仪器。c（c）,d日用DCA处理HCT-8/F和HCT116/F细胞（15 mM）/5-FU（50 μg/ml）和DCA（20 mM）/5-FU（25 μg/ml）。用结晶紫染色法测定菌落形成。Annexin V/PI染色检测细胞凋亡。三个独立实验的结果显示为平均值 ± 每个实验包括三个生物复制品。*P（P） < 0.05;**P（P） < 0.01;***P（P） < 0.001
图2
图2
miR-149-3p增强了5-FU在大肠癌中的化疗敏感性。一用20处理的HCT116细胞中差异表达的微小RNA图谱的热图 24 mM DCA 小时。b条24小时制备总RNA HCT116细胞经DCA处理后h。通过实时定量PCR对DCA处理后明显变化的microRNA进行定量。c（c）从HCT116、HCT116/F、HCT-8和HCT-8/F细胞中制备总RNA。采用实时定量PCR检测miR-149-3p的基础水平。d日,e（电子）HCT-8/F和HCT116/F细胞瞬时转染NC和miR-149-3p模拟物24小时 h、 用或不用5-FU（50 HCT-8/F和25μg/ml μg/ml（对于HCT116/F）。测定抑制率和细胞凋亡率。（f）,克测量转染NC或miR-149-3p模拟物的CRC细胞的葡萄糖消耗、乳酸生成、糖酵解和糖蛋白。三个独立实验的结果显示为平均值 ± 每个实验都包含至少三个生物复制品。*P（P） < 0.05;**P（P） < 0.01
图3
图3
DCA通过p53诱导miR-149-3p表达。一HCT116细胞和HCT-8细胞用20 mM和15 mM DCA，分别用于24 h.通过Western blot分析测定p53的表达。b条通过实时定量PCR测定p21、puma和MDM2的mRNA水平。c（c）用p53 siRNA、p53质粒和相应的阴性对照瞬时转染HCT116细胞和HCT-8细胞48个 h.通过Western blot分析测定p53的表达。d日通过实时定量PCR检测miR-149-3p的表达。e（电子）TP53型−/−用DCA和TP53处理HCT116细胞+/+用nutlin-3处理HCT116细胞。Western blot分析检测p53的表达。（f）TP53型−/−用DCA处理HCT116细胞24小时 h或转染p53质粒或对照质粒。克TP53型+/+用DCA和nutlin-3处理HCT116细胞24小时 h或DCA处理后转染p53 siRNA。通过实时定量PCR检测miR-149-3p的表达。小时HCT116细胞经或不经20 24 mM DCA h.三个独立实验的结果显示为平均值 ± 每个实验包含三个生物复制品。*P（P） < 0.05;**P（P） < 0.01;***P（P） < 0.001; ns无意义
图4
图4
PDK2是miR-149-3p的直接靶点。一用于搜索miR-149-3p预测调控的候选靶基因的方案示意图。b条用miR-149-3p模拟物或抑制剂瞬时转染HCT-8和HCT116细胞。通过实时定量PCR分析PDK2和HK1的mRNA水平。c（c）PDK2的3′-UTR中miR-149-3p假定结合位点的图。荧光素酶报告子中使用的突变序列用红色表示。d日人类胚胎肾脏293 T细胞和HCT116细胞被荧光素酶报告体和miR-149-3p模拟物（50 nmol/L）或miRNA对照共转染48个 h.将相对荧光素酶活性数据归一化为相应的对照。e（电子）HCT-8和HCT116细胞转染miR-149-3p模拟物或抑制剂48 h、 Western blot分析检测PDK2的表达。（f）转染miR-149-3p抑制剂或抗-NC抗体的HCT116细胞经DCA或不经DCA处理24小时 h.通过Western blot分析测定PDK2的表达。克Western分析PDK2和p-PDHA1在化疗敏感和化疗耐药CRC细胞中的表达。所示数据是三个实验的代表性图片。三次独立实验的结果显示为平均值 ± 扫描电镜。*P（P） < 0.05;**P（P） < 0.01;***P（P） < 0.001
图5
图5
miR-149-3p/PDK2信号抑制葡萄糖代谢并增加化疗敏感性。一通过在HCT-8/F细胞中瞬时转染siRNA来敲除PDK2。击倒导致p-PDHA1的改变。b条检测转染PDK2 siRNA或NC的CRC细胞的葡萄糖消耗、乳酸生成和糖酵解。c（c）HCT-8/F细胞接受或不接受50 μg/ml 5-FU，24小时 PDK2 siRNA或NC转染后h。通过Western blot分析测定细胞凋亡的识别生物标志物（c-PARP，Bax）。d日用5-FU处理转染PDK2 siRNA或NC的HCT-8/F细胞。细胞生长由CCK8测定。e（电子）用5-FU处理用PDK2 shRNA或阴性对照病毒感染的HCT-8/F细胞。用结晶紫染色法测定菌落形成能力。（f）HCT-8/F细胞转染NC或miR-149-3p模拟物24小时 h，然后感染过度表达PDK2的病毒。通过Western blot分析测定PDK2和p-PDHA1的表达。克测量葡萄糖消耗、乳酸生成和糖酵解。小时,我感染后，用5-FU处理细胞，测定细胞生长和集落形成能力。至少三次独立实验的代表性结果显示为平均值 ± 扫描电镜。*P（P） < 0.05;**P（P） < 0.01;***P（P） < 0.001
图6
图6
5-FU与DCA或miR-149-3p联合治疗可增强体内化疗效果。一每组肿瘤的代表性图像。b条计算腹腔注射组的异种移植瘤体积。平均值 ± 显示SD，n个 × 6c（c）腹腔注射组Ki-67异种移植瘤切片的免疫染色。阳性染色为棕色（比例尺：100 µm）（上面板）。计算Ki67的免疫反应评分（下表）。平均值 ± 显示SD，n个 × 4d日在瘤内组中，计算肿瘤接种后39天的异种移植瘤体积。e（电子）通过实时定量PCR检测DCA瘤内注射后异种移植瘤中miR-149-3p的表达。平均值 ± 显示SD，n个 × 6（f）显示了肿瘤内组小鼠的典型TUNEL染色切片（比例尺：50 微米）。克接受3周agomiR-NC或agomiR149-3p瘤内注射的小鼠肿瘤的代表性图像。小时计算治疗后21天内异种移植瘤的体积。平均值 ± SD被示出，n个 × 6我通过实时定量PCR分析miR-149-3p的水平。平均值 ± 显示SD，n个 × 5*P（P） < 0.05之间。j通过TUNEL分析测定肿瘤细胞的凋亡（比例尺：50 微米）。k个用所示抗体对每组三只小鼠的异种移植瘤进行免疫印迹分析。我异种移植瘤中PDK2阳性染色的可视化图像（比例尺：100 µm）（左侧面板）。计算PDK2的免疫反应评分（右表）。平均值 ± 显示SD，n个 × 三。米荷瘤小鼠的典型18F-FDG微-PET/CT图像。肿瘤用红色箭头和圆圈表示。在肿瘤中获得SUVmax和MTV的值。平均值 ± 显示SD，n个 × 三。*P（P） < 0.05；ns无意义
图7
图7
CRC患者miR-149-3p的表达与PDK2呈负相关。一通过线性回归分析确定miR-149-3p的表达与PDK2的相关性(n个 × 28中，第页 × −0.5058,P（P） < 0.01）和b条一对t吨-用相同的样品进行测试(P（P） < 0.001）。c（c）通过TCGA数据集中PDK2的表达对CRC患者的OS进行分层(n个 × 603,P（P） × 0.0486,P（P）值是通过log-rank检验获得的）。d日使用非配对法测定wt p53和突变p53组PDK2的mRNA水平t吨-测试分析(P（P） × 0.0057）。e（电子）一幅卡通素描描绘了DCA通过p53/miR-149-3p/PDK2介导的葡萄糖代谢途径恢复CRC对化疗的反应
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