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.2019年12月；42(6):2245-2254.
doi:10.3892或2019.7345。 Epub 2019年10月1日。

无嘌呤核酸内切酶1通过诱导Parkin介导的线粒体自噬促进肺癌细胞对顺铂的耐药性

郑丽 1, 王永强 1, 吴林波 1, 鸭绿洞 1, 张静（音译） 1, 范晨 1, 魏燮 1, 黄建国 1, 宁路 1
附属公司

Apurinic核酸内切酶1通过诱导Parkin‑介导的有丝分裂促进肺癌细胞对顺铂的耐药性

郑丽等。 及国际医学权威期刊. 2019年12月.

摘要

含铂双重化疗是肺癌治疗的基石；然而，顺铂耐药性是肺癌治疗的主要障碍。然而，这种抵抗的机制尚未完全阐明。先前的研究表明，非小细胞肺癌患者的血清无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1（APE1）水平与含铂双重化疗后的无进展生存率呈负相关，可作为预测疾病预后和治疗效果的生物标志物。本研究旨在探讨APE1在肺癌顺铂耐药中的作用。采用western blotting分析顺铂耐药A549细胞系（A549/DDP）和顺铂敏感A549细胞线粒体无嘌呤核酸内切酶1（m‑APE1）和总APE1（t‑APE）蛋白水平。采用JC‑1染色法检测线粒体膜电位。通过细胞凋亡和集落形成分析评估APE1过度表达的A549细胞和APE1沉默的A549/DDP细胞的顺铂耐药性。结果表明，抗顺铂A549细胞含有高水平的APE1，并表现出较高的自噬水平。与A549细胞中的m‑APE1和t‑APEl蛋白水平相比，A549/DDP细胞中的这些蛋白水平增加。APE1和Mia40的过表达增强了A549细胞的顺铂耐药性和自噬。APE1敲除可恢复A549/DDP细胞中的顺铂敏感性，降低LC3II和Parkin水平，但可促进细胞色素c的释放。此外，Parkin沉默或用3‑甲基腺嘌呤（3‑MA，一种自噬抑制剂）治疗可促进APE1‑过表达A549细胞的凋亡，表明Parkin‑介导的有丝分裂在APE1‑诱导的A549细胞顺铂耐药中起重要作用。总之，APE1通过诱导Parkin介导的有丝分裂促进肺癌细胞对顺铂的耐药性。

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数字

图1。
图1。
抗顺铂A549细胞表现出高水平的APE1和自噬。（A） 用0、1、2、3、4、5和6µmol/l顺铂处理A549细胞24小时，用0、10、20、30、40、50和60µmol/l顺铂治疗A549/DDP细胞24小时。（B） Western blot分析A549/DDP和A549细胞线粒体APE1（m-APE1）蛋白水平。COX4被用作线粒体APE1蛋白的负荷控制。（C） A549/DDP和A549细胞中总APE1（t-APE1）和Mia40蛋白水平的Western blot分析。GAPDH被用作负荷控制。（D） A549/DDP和A549细胞中LC3蛋白水平的Western blot分析。（E和F）进行免疫荧光分析，以评估A549和A549/DDP细胞中的总APE1和总LC3水平。数据表示从三个独立实验中获得的结果（三份样品的平均值±SEM）***与0µmol/l顺铂处理的A549或A549/DDP细胞相比，P<0.001。APE1，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1；LC3，微管相关蛋白1A/1B-轻链3。
图2。
图2。
APE1和Mia40过度表达增加A549细胞的顺铂抵抗。用含有APE1过表达质粒和Mia40过表达质粒的载体转染A549细胞。（A） qPCR检测转染效率。（B） 转染A549细胞后线粒体APE1（m-APE1）蛋白水平的Western blot分析。COX4被用作线粒体APE1的负荷控制。（C） Western blot分析转染A549细胞后总APE1（t-APE1）和Mia40蛋白水平。GAPDH被用作负荷控制。（D） 进行免疫荧光分析以评估转染后A549细胞中APE1的总水平。（E） 用0、1、2、3、4、5和6µmol/l顺铂处理转染的A549细胞24小时，并通过CCK-8分析评估其生存能力。（F） 进行集落形成测定以分析转染的A549细胞的集落形成效率*与矢量组相比，P<0.05，***P<0.001。#与APE1组相比，P<0.05。APE1，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1；LC3，微管相关蛋白1A/1B-轻链3。（G） 流式细胞术分析转染后JC-1的细胞分布。（H） 用顺铂处理转染的A549细胞，并用流式细胞术分析其凋亡率。（一） 将转染的A549细胞进行分馏以获得细胞溶质部分。Western blot分析LC3、总细胞色素水平c（c），和Parkin在转染的A549细胞中的表达。（J） 细胞凋亡率如直方图所示。GAPDH被用作负荷控制。数据表示从三个独立实验中获得的结果（三份样品的平均值±SEM）****与矢量组相比，P<0.0001。APE1，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1；LC3，微管相关蛋白1A/1B-轻链3。
图2。
图2。
APE1和Mia40过度表达增加A549细胞的顺铂抵抗。用含有APE1过表达质粒和Mia40过表达质粒的载体转染A549细胞。（A） qPCR检测转染效率。（B） 转染A549细胞后线粒体APE1（m-APE1）蛋白水平的Western blot分析。COX4被用作线粒体APE1的负荷控制。（C） Western blot分析转染A549细胞后总APE1（t-APE1）和Mia40蛋白水平。GAPDH被用作负荷控制。（D） 进行免疫荧光分析以评估转染后A549细胞中APE1的总水平。（E） 用0、1、2、3、4、5和6µmol/l顺铂处理转染的A549细胞24小时，并通过CCK-8分析评估其生存能力。（F） 进行集落形成分析以分析转染A549细胞的集落形成效率*与矢量组相比，P<0.05，***P<0.001。#与APE1组相比，P<0.05。APE1，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1；LC3，微管相关蛋白1A/1B-轻链3。（G） 流式细胞术分析转染后JC-1的细胞分布。（H） 用顺铂处理转染的A549细胞，并用流式细胞术分析其凋亡率。（一） 将转染的A549细胞进行分馏以获得细胞溶质部分。Western blot分析LC3、总细胞色素水平c（c）和Parkin在转染的A549细胞中。（J） 细胞凋亡率如直方图所示。GAPDH被用作负荷控制。数据表示从三个独立实验中获得的结果（三份样品的平均值±SEM）****与载体组相比，P＜0.0001。APE1，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1；LC3，微管相关蛋白1A/1B-轻链3。
图3。
图3。
APE1敲除增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。用小干扰RNA（si-APE1或si-NC）转染A549/DDP细胞。（A） qPCR检测转染效率。（B） 通过蛋白质印迹分析转染的A549/DDP细胞中线粒体APE1（m-APE1）的水平。COX4被用作线粒体APE1的负荷控制。（C） western blotting分析转染A549/DDP细胞中总APE1（t-APE1）蛋白水平。GAPDH被用作负荷控制。（D） 进行免疫荧光分析以评估转染后A549/DDP细胞中APE1的总水平。（E） 用15µmol/l顺铂处理转染的A549/DDP细胞24小时，并通过CCK-8分析评估其生存能力。（F） 通过集落形成实验分析转染A549/DDP细胞的集落形成效率。（G） 用顺铂处理转染的A549/DDP细胞，并用流式细胞术分析其凋亡率。（H） 流式细胞术分析转染后JC-1的分布。（一） 将转染的A549/DDP细胞进行分馏以获得细胞溶质部分。Western blot分析LC3、总细胞色素水平c（c）（J）细胞凋亡率如直方图所示。GAPDH被用作负荷控制。数据表示从三个独立实验中获得的结果（三份样品的平均值±SEM）*与si-NC组相比，P<0.05、***P<0.001和***P<0.0001。APE1，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1；LC3，微管相关蛋白1A/1B-轻链3。
图4。
图4。
Parkin介导的有丝分裂在APE1诱导A549细胞顺铂耐药中起重要作用。首先用APE1过表达质粒转染A549细胞。接下来，用小干扰RNA（si-Parkin或si-NC）转染过表达APE1的A549细胞，或用3-MA处理。（A）相关转染（APE1、si-Parkin或si-NC）后，对A549细胞进行分级处理，以获得细胞溶质部分。进行蛋白质印迹分析以分析LC3、总细胞色素的水平c（c）和Parkin在细胞溶质部分。GAPDH被用作负荷控制。（B） 在指示的转染和处理后，A549细胞与3µmol/l顺铂共培养24 h，并通过CCK-8分析评估其生存能力。（C） 进行集落形成分析，以分析转染A549细胞在接受指定处理后的集落形成效率。（D） 细胞凋亡率如柱状图所示。（E） 流式细胞术分析经3-MA处理和未经3-MA治疗的转染A549细胞的凋亡率。（F） 流式细胞术分析JC-1在转染A549细胞中的分布*与APE1组相比，P<0.05和****P<0.0001。3-MA，3-甲基腺嘌呤（一种自噬抑制剂）；APE1，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1；LC3，微管相关蛋白1A/1B-轻链3。
图5。
图5。
示意图显示了APE1在肺癌顺铂耐药信号电路中的作用。APE1，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1；LC3，微管相关蛋白1A/1B-轻链3。
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