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.2019年10月3日；4（19）：e129110。
doi:10.1172/jci.insight.129110。

KIAA0317通过SOCS2降解调节肺部炎症

特拉维斯·B·李尔 1 2, 艾莉森·麦克维 1, 约翰·W·埃文科维奇 1, 施里斯蒂·拉吉班达里 1, 蒂芙尼A Coon 1, 莎拉·邓恩 1, 詹姆斯·隆迪诺 1, 布莱恩·麦克维里 1 2, 张迎泽 1, 埃莉诺·瓦伦齐 三, 克里斯汀·伯顿 1, 雷切尔·戈登 4, 塞巴斯蒂安·金格斯 4, 卡琳娜·C·洛克伍德 5, 迈克尔·朱尔恰克 6, 罗伯特·拉菲亚蒂斯 三, 马克·施隆奇克（Mark J Shlomchik） 4, 袁刘（音） 1 5 7, 比尔·B·陈 1 5 8
附属公司

KIAA0317通过SOCS2降解调节肺部炎症

特拉维斯·B·李尔等。 JCI洞察力. .

摘要

炎症因子释放失调与肺炎、脓毒症和急性呼吸窘迫综合征等几种危及生命的急性肺部疾病的发病机制有关。细胞因子信号蛋白的抑制剂，特别是SOCS2，最近被描述为抗炎介质。然而，尚未描述SOCS2蛋白的调节。在这里，我们描述了泛素E3连接酶KIAA0317作用的SOCS2调节机制。KIAA0317介导的SOCS2降解在体外加剧了炎症，体内KIAA0317-的耗竭改善了肺部炎症。KIAA0317基因敲除小鼠对脂多糖诱导的肺部炎症表现出抵抗力，而KIAA03017的再表达减轻了这种作用。我们发现了一种小分子KIAA0317蛋白抑制剂（BC-1365），它可以阻止SOCS2降解，并减轻LPS和铜绿假单胞菌诱导的体内肺部炎症。这些研究表明，KIAA0317通过降解SOCS2而成为肺部炎症的关键介质，是治疗抑制的潜在候选靶点。

关键词：炎症；先天免疫；肺病学；泛素蛋白体系统。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：本研究中描述的工作受英国广播公司的美国专利10344003保护，涵盖KIAA0317抑制剂和其他修饰。该专利是通过匹兹堡大学联邦高等教育体系申请的。

数字

图1
图1。SOCS2蛋白在肺部炎症期间普遍存在并降解。
(A类)ARDS患者或对照血清样本白细胞颗粒的免疫印迹分析。数据表示平均值±SEM(n个= 7–10; ***P（P）与对照组Mann-Whitney相比<0.001单位测试）。(B类)SOCS2转录单细胞RNA测序的对照肺组织细胞的细胞类型聚类结果。(C类)CHX（50μg/mL）、MG132（20μM）或leupeptin（50μg/mL）治疗指定时间后进行免疫印迹，并在MLE细胞中异位表达V5标记的SOCS2。(D类)MLE细胞中泛素（Ubi）过度表达后的免疫印迹。(E类)MLE细胞免疫沉淀后SOCS2泛素化的UbiCRest分析；消化上清液如下所示，氘酶酶用星号表示。Ctrl，控制；CD，催化域。(F类)SOCS2-V5和泛素赖氨酸-精氨酸突变体表达后的免疫印迹分析。(G公司)SOCS2-HIS和HA-ubiquitin表达后MLE细胞的免疫印迹分析。HIS PD后，免疫印迹洗脱液以检测HA泛素信号。(H（H）)LPS处理MLE细胞指定时间的qPCR分析。数据代表平均值±SEM(n个= 3; NS、，P（P）>0.05与0小时相比；学生的双尾未配对t吨测试）。(C类——G公司)数据代表了n个=2–3个独立实验。
图2
图2。KIAA0317在细菌攻击下泛素化和降解SOCS2。
(A类)在质谱分析之前，对对照GST和SOCS2-GST诱饵的洗脱液进行蛋白质染色，并捕获BEAS-2B裂解液。(B类)在MLE细胞中异位表达空质粒或V5-tagged KIAA0317的情况下，CHX治疗（50μg/mL）指定时间后进行免疫印迹。(C类)SOCS2蛋白质密度测定（归一化为肌动蛋白）B类(n个= 2). (D类)CHX治疗（50μg/mL）指定时间后进行免疫印迹，Ctrl-shRNA或起亚0317MLE细胞中的shRNA。(E类)SOCS2蛋白质密度测定（归一化为肌动蛋白）D类(n个= 2). (F类和G公司)SOCS2免疫印迹(F类)KIAA0317和(G公司)UBE3B在MLE细胞中的表达。(H（H）)与KIAA0317和泛素共表达后的体内泛素化检测和SOCS2免疫沉淀。(我)SOCS2蛋白的体外泛素化测定。(J型)KIAA0317表达和LPS暴露后SOCS2 PD的免疫印迹分析。(K（K）和L（左）)用对照shRNA（CON）或KIAA0317号机组shRNA并暴露于(K（K）)LPS（10μg/mL）或(L（左）)TNF（10 ng/mL）处理指定时间。数据代表平均值±SEM(n个= 4; *P（P）< 0.05; ****P（P）< 0.0001; NS、，P（P）>与指示的治疗、对照shRNA 6小时治疗（†）或对照shRNA 18小时治疗（#）相比，0.05。使用Bonferroni的多重比较测试进行双向方差分析。(F类——J型)数据代表了n个=2–3个独立实验。
图3
图3。KIAA0317针对SOCS2磷酸化简并子进行结合和泛素化。
(A类)机械研究中使用的SOCS2缺失或点突变示意图。(B类)在CHX（50μg/mL）处理指定时间后，对表达SOCS2赖氨酸突变体的MLE细胞进行免疫印迹分析。(C类)绑定KIAA0317的SOCS2位点的删除映射。(D类)对表达SOCS2 S52N的MLE细胞进行免疫印迹分析，然后用CHX（50μg/mL）处理指定时间。(E类)SOCS2 S52N结合KIAA0317的免疫印迹分析。(F类)用WT SOCS2或不含KIAA0317或与KIAA0317共转染的S52N或K173R突变体共转染的MLE细胞的免疫印迹。这些车道是在相同的凝胶上行驶的，但不连续。(G公司)机械研究中使用的KIAA0317缺失或点突变体示意图。(H（H）和我)删除KIAA0317位点并进行点映射以结合SOCS2。(J型)KIAA0317 P779L与SOCS2的结合分析。(K（K）)KIAA0317肽结合试验。(L（左）)增加剂量下表达KIAA0317 WT和P779L的MLE细胞的免疫印迹分析。在B类——F类和H（H）——L（左），数据代表n个=2个独立实验。
图4
图4。起亚0317击倒改善假单胞菌属-体内诱发肺损伤。
(A类)慢病毒感染的治疗策略（1×107PFU/小鼠）和PA103暴露（1×104CFU/鼠标）。对小鼠实施安乐死，用生理盐水洗肺并收获。Con，控制。(B类——D类)治疗小鼠BALF中的蛋白质浓度、细胞计数和细菌计数测量(n个=每组6-8只小鼠）。在D类，方框表示四分位间距；中线；和胡须，最高和最低值。(E类和F类)BALF细胞因子IL-6和TNF的ELISA分析。(G公司)暴露于PA103（i.t.1×10）的小鼠存活研究5CFU/鼠标，n个=每组8只小鼠）。随着时间的推移，对小鼠进行监测；濒死、濒死的动物立即被安乐死，并记录为死亡。生成Kaplan-Meier生存曲线并进行比较；数据表示平均值(n个=每组8只小鼠）。(H（H）)来自代表性小鼠肺匀浆的免疫印迹分析；n个=每组4人。(我)H&E染色后小鼠肺的组织学；比例尺：100μm**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001，标准偏差：P（P）>0.05与对照shRNA相比，双尾未配对学生t吨测试(B类——F类)或与对照shRNA、log-rank（Mantel-Cox）试验进行比较(G公司).
图5
图5。起亚0317敲除可以保护机体免受LPS诱导的肺部炎症的影响。
(A类)sgRNA靶位点扩增起亚0317+/+,起亚0317+/–、和起亚0317–/–老鼠。(B类)起亚0317转录水平起亚0317+/+,起亚0317+/–、和起亚0317–/–老鼠。数据代表平均值±SEM(n个=3只小鼠）。(C类——G公司)起亚0317+/+,起亚0317+/–、和起亚0317–/–小鼠静脉接种LPS（3mg/kg）18小时。数据代表平均值±SEM(n个=每组3只小鼠）。(C类和D类)BALF中的蛋白质浓度和细胞计数。(E类)BALF IL-6浓度。(F类)BALF TNF浓度。(G公司)BALF IL-1β浓度。(H（H）)H&E染色后小鼠肺的组织学；比例尺：100μm*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）与指定组或性别特异性+/+组相比，<0.0001；Tukey多重比较的单因素方差分析(B类)或使用Dunnett的多重比较测试进行单因素方差分析(C类——G公司).
图6
图6。KIAA0317在中的重新表达起亚0317–/–小鼠消炎。
用空慢病毒或编码KIAA0317 WT或KIAA0317 P779L的慢病毒（1×107PFU/小鼠）。暴露后，对小鼠实施安乐死，用生理盐水洗肺并收获。(A类和B类)BALF中的蛋白质浓度和细胞计数测量。(C类——E类)BALF细胞因子浓度。(F类——H（H）)BALF白细胞分类。(A类——H（H）)数据代表平均值±SEM(n个=4–7只小鼠*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）<0.001与起亚0317+/+小鼠，单因素方差分析和Dunnett的多重比较）。(我)H&E染色后小鼠肺的组织学；比例尺：200μm*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001与起亚0317+/+老鼠；用Dunnett的多重比较检验进行单因素方差分析(A类——H（H）).
图7
图7。受保护的表型起亚0317–/–小鼠需要SOCS2。
小鼠经i.t.感染编码控制shRNA的慢病毒或社会2shRNA（1×107PFU/小鼠）。暴露后，对小鼠实施安乐死，用生理盐水洗肺并收获。(A类和B类)BALF中的蛋白质浓度和细胞计数测量。(C类——E类)BALF细胞因子浓度。(F类——H（H）)BALF白细胞分类。在A类——H（H），数据代表平均值±SEM(n个=5-6只小鼠）。(我)H&E染色后小鼠肺的组织学；比例尺：200μm*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001,****P（P）与对照shRNA相比<0.0001-起亚0317+/+小鼠或如指示；采用Tukey多重比较测试的单因素方差分析。
图8
图8。KIAA0317的化学抑制可在体外防止SOCS2降解和炎症。
(A类)KIAA0317 HECT结构域的结构分析显示，HECT结构区的C末端有一个主腔。(B类和C类)候选抑制剂BC-1365与KIAA0317-HECT结构域的对接研究。(D类)BC-1365竞争测定。在免疫印迹分析之前，用KIAA0317结合树脂培养SOCS2蛋白并滴定BC-1365。PDs中检测到的SOCS2的相对数量根据载体进行标准化和量化。数据代表平均值±SEM(n个= 3). (E类)BC-1365滴定后MLE细胞的免疫印迹分析。数据代表平均值±SEM(n个= 4). (F类)在qPCR分析之前，将MLE细胞暴露于BC-1365滴定液中18小时。数据代表平均值±SEM(n个= 4). NS公司：P（P）> 0.05, *P（P）< 0.05, **P（P）与车辆治疗相比<0.01；用Dunnett的多重比较检验进行单因素方差分析(E类和F类).
图9
图9。KIAA0317小分子抑制剂具有体内抗炎作用。
(A类——E类)将C57BL/6J小鼠暴露于PA103，并用BC-1365治疗18小时。暴露后，处死小鼠，用生理盐水洗肺并收获。方框表示四分位范围；中线；和胡须，最高和最低值。(A类——C类)BALF中的细菌计数、蛋白质浓度和细胞计数测量。(D类——F类)BALF细胞因子浓度。车辆，车辆。在A类——F类，数据代表平均值±SEM；n个=4-8只小鼠。国家：P（P）> 0.05, *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）与对照组小鼠相比或如所示，<0.0001；采用Tukey多重比较测试的单因素方差分析。(G公司)小鼠肺匀浆Kiaa0317和Socs2蛋白信号的免疫印迹；n个=每次治疗3只小鼠。(H（H）)H&E染色后小鼠肺的典型组织学；比例尺：100μm。
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