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.2019年9月11日12:212。
doi:10.3389/fnmol.2019.00212。 2019年eCollection。

Leber's先天性黑色素沉着症患者诱导多能干细胞和视网膜器官的制备与鉴定RPE65型突变

李桂兰 1, 高冠捷 1, 王攀峰（Panfeng Wang） 1, 宋晓静 1, 徐萍（Ping Xu） 1, 谢冰冰 1, 周天成 2, 潘广金 2, 彭福华 三, 张庆炯 1, Jian Ge公司 1, 钟秀峰 1
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Leber's先天性黑色素沉着症患者诱导多能干细胞和视网膜器官的制备与鉴定RPE65型突变

李桂兰等。 前磨牙神经科学. .

摘要

RPE65相关的Leber先天性黑色素沉着症（LCA）是一种高度异质性、早发型、严重视网膜营养不良症，至少有130个基因突变位点。由于缺乏病细胞，其致病性尚未直接阐明。在这里，我们从一名假定的LCA患者中产生了人诱导多能干细胞（hiPSCs），该患者携带两种新的RPE65型具有c.200T>G（p.L67R）和c.430T>c（p.Y144H）的突变，命名为RPE65-hiPCSs，已确认包含相同的突变。RPE65-hiPCS在NOD-SCID小鼠中表现出典型的形态特征，核型正常，表达多能性标记，并发生畸胎瘤。此外，hiPSC患者能够区分视网膜谱系命运和具有分层神经视网膜的自形成视网膜器类。所有主要的视网膜细胞类型，包括光感受器和视网膜色素上皮（RPE）细胞，也是随着时间的推移而获得的。与健康对照组相比，患者iPSCs的RPE细胞RPE65表达较低，但吞噬活性和VEGF分泌水平相似。本研究提供了有价值的患者特异性、疾病靶向的视网膜类有机物，包括光感受器和RPE细胞，这将有助于研究疾病的个性化致病机制、药物筛选和细胞替代治疗。

关键词：RPE65基因突变；区别；重新编程；视网膜变性；视网膜类器官。

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数字

图1
图1
RPE65-hiPCS的产生和扩增。（A）从UC生成无集成RPE65-hiPCS的示意图概述。（B）UCs重新编程后RPE65-hiPCS菌落的逐渐形成。黑色箭头显示出正在出现的克隆。（C）出现的克隆AP染色阳性。（D）从初级克隆中人工采摘的一小丛在D6上逐渐形成典型的克隆。（E）用EDTA处理传代RPE65-hiPCS克隆。比例尺，250μm。（F）Sanger测序证实来自LCA患者的hiPSC包含复合RPE65基因突变，c.200T>G和c.430T>c。（G）从七叶β螺旋桨的底面观察人类RPE65单体的结构。叶片编号为I–VII。绝对保守的His180、His241、His313和His527残基显示为与天然结合铁离子配位的棒状物。两个突变位点Leu67（L67）和Tyr144（Y144）分别显示为蓝色和绿色。
图2
图2
非整合RPE65患者特异性hiPSC的特征。（A）RPE65-hiPCs（C11-1，P5）多能性标记物（OCT4，SOX2，NANOG，SSEA4，TRA-1-81和TRA-1-60）的免疫荧光染色。比例尺，50μm。（B）通过RT-PCR对RPE65-hiPCS（C11-1、P1、P4和P7）中的上位体载体进行非整合分析。（C）G带分析表明，RPE65-hiPCS（C11-1的代表性结果）核型正常。（D）NOD-SCID小鼠RPE65-hiPSC畸胎瘤的HE染色分析。比例尺，100μm。
图3
图3
从RPE65-hiPCS中获取视网膜类器官和RPE细胞。（A）视网膜分化方案的示意图概述。（B）漂浮的胚状体（EB）。（C）电子束镀在D7的Matrigel-coated盘子上。比例尺，200μm。（D）粘附的EB获得以PAX6和SOX1表达为特征的前神经上皮命运。比例尺，50μm。（E–G）在D12周围出现SIX3、OTX2和LHX2阳性视网膜前体细胞。比例尺，20μm。（H）qRT-PCR显示RPE65-hiPCS视网膜发生过程中视网膜前体标记物PAX6和VSX2以及RPE标记物MITF的表达水平逐渐增加。RPE65-hiPCS衍生EB（D5）作为参考。平均值±标准偏差,n个= 3.（I–L）视网膜分化后D16上对照组和RPE65 hiPSC视网膜前体标记物（PAX6、VSX2和RX）和RPE标记物（MITF）mRNA表达水平的比较。控制hiPSC衍生EB（D5）作为参考。他们之间没有重大差异(P（P）>0.05），平均值±标准偏差,n个= 3.（百万）马蹄状NR畴的典型形态。比例尺，200μm。（N）含有NR和RPE的视网膜类器官的代表性图像。比例尺，200μm。（O、P）免疫荧光染色显示，分化后的D35天，表达VSX2和MCM2的视网膜前体细胞占据了整个神经视网膜。比例尺，20μm。
图4
图4
RPE65-hiPCS产生具有所有视网膜细胞类型的分层视网膜器样体。与健康对照组相比，RPE65-hiPCS衍生的视网膜有机物中的神经视网膜形成了分层结构，所有主要的视网膜细胞类型都位于相应的层中。（A）棕色3+视网膜神经节细胞位于基底侧，（B）OTX2型+位于顶端的感光细胞，（C、D）AP2（AP2）+无分泌细胞和PROX1+位于中间层的水平细胞，（E）蛋白激酶-a+双极电池，以及（F）CRALBP公司+米勒胶质细胞。比例尺，20μm。
图5
图5
患者视网膜类器官的光受体亚型规范。（A）D150上来自RPE65-hiPCS的视网膜类器官的代表性图像。比例尺，200μm。（B）患者视网膜类器官中的感光细胞形成了外核层状结构，表达感光细胞泛标记物Recoverin.比例尺，20μm。（C）患者的光感受器细胞有能力发展出包括红细胞色素在内的所有亚型+杆，L/M视蛋白+红/绿锥体和S视蛋白+蓝色圆锥体。比例尺，20μm。（D–G）透射电镜显示，RPE65-hiPSC衍生的感光细胞具有典型的超微结构，外界膜（OLM，星号）、内段（IS）具有丰富的线粒体（m）、中心粒（C）、基底体（BB）（白色箭头）和连接纤毛（黑色箭头）。比例尺，1μm（D），0.5微米（E），0.2微米（F）和1μm（G）.
图6
图6
患者RPE细胞中RPE65的表达降低。（A）色素RPE细胞（虚线区域）与RPE65-hiPCS分化。（B）中虚线区域的放大倍数更高A类.比例尺，100μm。（C）分化后的W8上所选RPE片。比例尺，100μm。（D）qPCR分析显示，患者RPE细胞（C11-1和C4）中RPE65的表达水平显著低于对照（UE022），而患者RPE细胞中的MITF和CRALBP与对照相当。∗P（P）< 0.05. 数据表示为平均值±标准偏差,n个= 3.（E）免疫荧光染色显示，RPE65在RPE65-hiPCS衍生的RPE细胞中呈阴性，而在对照hiPSCs衍生的RPE细胞中呈阳性，而CRALBP和ZO-1在患者和对照RPE细胞均呈强阳性。比例尺，20μm。
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