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.2020年3月;100(3):454-465.
doi:10.1038/s41374-019-0327-5。 Epub 2019年9月30日。

大麻素受体1敲除通过下调紫苏素2减轻肝脏脂肪变性

附属公司

大麻素受体1敲除通过下调紫苏素2减轻肝脏脂肪变性

卡鲁娜·伊伦巴姆等。 实验室投资. 2020年3月.

摘要

内源性大麻素(EC)系统与包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在内的几种代谢性疾病的发病机制有关。在目前的研究中,我们旨在验证内源性大麻素受体1(CB1)信号对周脂素2(PLIN2)介导的脂吞噬的调节作用。在这里,我们证明大麻素受体1基因(CB1)的全球敲除-/-)降低CB1肝中脂滴结合蛋白PLIN2的表达-/-和乙型肝炎表面蛋白(HBs)转基因小鼠,自发形成肝脂肪变性。此外,细胞培养中CB1的药理激活和拮抗也分别导致PLIN2的诱导或降低。PLIN2表达降低与抑制脂肪生成和甘油三酯(TG)合成以及增强自噬有关,如LC3B与溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)在HBs/CB1中的共定位增加-/-老鼠。LAMP1在CB1中的表达增加进一步支持了自噬的诱导-/-和HBs/CB1-/-老鼠。LAMP1和PLIN2在HBs/CB1中共同定位-/-表明细胞质脂滴(LD)的自噬,即脂类吞噬。溶酶体酸脂肪酶的高表达还表明脂滴的脂解。总之,这些结果表明,CB1信号的丢失导致PLIN2丰度的降低,从而触发脂吞噬。我们关于CB1信号传导和PLIN2之间关系的新发现可能会刺激翻译研究,分析NAFLD的新诊断和治疗方案。

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数字

图1
图1
CB1受体敲除降低了小鼠的体重和肝脏脂质积聚。条形图显示52周龄CB1的体重显著下降−/−和HBs/CB1−/−将小鼠与WT和HBs进行比较。描述为手段±扫描电镜,n个 = 8–12.b条CB1组肝脏重量减轻−/−-在HBs转基因小鼠中增强。c(c)52周龄小鼠肝脏的代表性油红O染色。肝甘油三酯分析显示52周龄CB1大鼠肝脏TGs水平显著降低−/−和HBS/CB1−/−老鼠。n个 = 7–9.e(电子)典型的薄层色谱分析显示52周龄小鼠肝组织的总脂质谱不同。胆固醇、OA/PA油酸/棕榈酸、TGs甘油三酯
图2
图2
CB1敲除降低了HBs转基因小鼠的肝脏PLIN2。PLIN2的定量实时PCR分析显示CB1中PLIN2 mRNA减少−/−和HBS/CB1−/−-老鼠。将数据归一化为β-actin作为参考基因,并显示为相对表达(ΔΔCt)。b条52周龄小鼠肝脏总蛋白裂解物的Western blot分析显示HBs/CB1中PLIN2蛋白水平降低−/− 老鼠。c(c)使用特异性抗PLIN2抗体(红色)对52周龄小鼠的石蜡包埋肝脏切片进行免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。原始放大倍数×1000,巴40微米
图3
图3
CB1的药理拮抗作用降低了细胞培养中PLIN2的表达AML12细胞在148μM最终浓度在不存在或存在油酸(200微米)。Western blot分析表明,meth-AEA增强了PLIN2的表达,rimo治疗降低了PLIN1的表达。使用抗GAPDH抗体证实了相同的蛋白质负载。图中显示了具有代表性的Western Blot。b条利莫那班或meth-AEA处理的AML12细胞中PLIN2(红色)的免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。显示了代表性染色。原始放大倍数×400,bar 100微米。c(c)不同剂量(0.1、0.5、1和2)的利莫那班治疗AML12细胞中PLIN2表达的剂量依赖性下降µM)。在油酸(200微米)。用特异性PLIN2抗体对细胞裂解产物进行western blot分析。使用抗GAPDH抗体确认蛋白质负载量相等
图4
图4
CB1基因敲除提高了HBs转基因小鼠肝脏的自噬。使用抗LC3B抗体对52周龄小鼠的石蜡包埋肝脏切片进行代表性免疫组化分析。原图放大倍数×1000,40巴微米。b条用ImageJ软件评估LC3B点的定量,并表示为LC3B染色/视野的%。c(c)使用特异性抗LC3B和抗p62抗体对52周龄小鼠的裂解物进行Western blot分析。使用特异性抗LAMP1抗体(红色)对52周龄小鼠的石蜡包埋肝脏切片进行代表性免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。放大倍数×1000,巴40微米
图5
图5
使用特异性抗LC3B(绿色)和LAMP1(红色)抗体对52周龄小鼠的石蜡包埋肝脏切片进行双重免疫荧光分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。这两种蛋白质呈黄色。放大倍数×1000比例尺40微米。b条使用抗p62(绿色)和抗LAMP1(红色)抗体对52周龄小鼠的石蜡包埋肝脏切片进行代表性双重免疫荧光分析。箭头表示这些蛋白的共定位,以黄色显示,p62在核包涵体中积聚。原图放大倍数×1000,条数40微米。c(c)使用特异性抗LAL(溶酶体酸脂肪酶)抗体对52周龄小鼠的石蜡包埋肝脏切片进行代表性免疫组化分析。原始放大倍数×200和×1000,条形图100微米。PLIN2(蓝色)和LAMP1(红色)的代表性免疫组织化学分析。箭头显示成本计算区域(紫色)。原始放大倍数×200和×1000,bar 100微米
图6
图6
CB1基因敲除诱导HBs转基因小鼠的脂肪生成抑制。使用特异性抗MGAT1、抗FASN和抗ACC1抗体对52周龄小鼠的肝裂解物进行Western blot分析。等蛋白负荷分别由抗GAPDH和抗β-肌动蛋白抗体控制。b条条形图表示将MGAT1蛋白表达标准化为GAPDH。统计、单因素方差分析、克鲁斯卡尔-沃利斯检验(P(P) = 0.004),进行Dunnet多重比较试验。c(c)对MGAT1转录物进行实时定量PCR(qRT-PCR)分析。不同样本中的RNA量归一化为β-actin作为参考基因,并显示为相对表达(ΔΔCt)。在GraphPad,单向方差分析(Kruskal–Wallis检验,P(P) = 0.0053). 采用Dunn多重比较试验进行组间比较。使用特异性DGAT1抗体对石蜡切片进行代表性免疫组化。放大倍数,×200 bar 200微米

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