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.2020年1月2日；130(1):143-156.
doi:10.11172/JCI128513。

线粒体DNA维持基因SSBP1的显性突变导致视神经萎缩和眼窝病

卡米尔·皮罗·梅吉 1, 艾曼纽尔·萨尔齐 1, Aleix Tarrés-Solé 2, 玛丽·佩奎诺特 1, 芬娜·亨森 三, 梅兰妮·奎莱丝 1, 盖尔·马内斯 1, Arka Chakraborty公司 2, 奥黛丽·塞恩查尔 1, 贝亚特里·博奎特 1 4, 尚塔尔·卡泽维耶 1, 阿加特·鲁贝蒂 1 4, 阿格内斯·米勒 1 5, 马吉达·查里夫 6, 大卫·古登埃 6, 盖·勒纳尔 6, 赫尔穆特·威廉姆 7, 乌尔里希·凯尔纳 8, 妮可·魏斯丘（Nicole Weisschuh） 9, 伯恩德·维辛格 9, 泽维尔·赞隆吉 10, 克里斯蒂安·哈默尔 1 4, 约翰内斯·斯佩尔布林克 三, 玛丽亚·索拉 2, Cécile删除 1
附属公司

线粒体DNA维持基因SSBP1的显性突变导致视神经萎缩和眼窝病

卡米尔·皮罗·梅吉等。 临床研究杂志. .

摘要

线粒体DNA（mtDNA）复制机制编码成分的基因突变会导致线粒体DNA缺失综合征（MDS），该综合征将眼部特征与严重的神经综合征联系起来。在这里，我们在5个不相关的家族中发现了单链结合蛋白1（SSBP1）的杂合错义突变，导致线粒体单链DNA结合蛋白（一种参与线粒体DNA复制的关键蛋白）中的R38Q和R107Q氨基酸发生变化。所有受影响的患者均出现视神经萎缩，其中一半患者伴有眼窝病。为了揭示SSBP1突变的结构特征，我们确定了一个修正的SSBP1晶体结构。结构分析表明，这两种突变都会影响二聚体的相互作用，并可能扭曲DNA结合区域。使用患者成纤维细胞，我们验证了R38Q变体破坏SSBP1二聚体/四聚体的形成，影响线粒体DNA复制，并诱导线粒体DNA耗竭。我们的研究表明，SSBP1的突变导致一种常见的显性视神经萎缩，并伴有黄斑病变，这为线粒体DNA维持障碍提供了新的见解。

关键词：遗传学；线粒体；神经变性；眼科学。

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利益冲突声明

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
图1。SSBP1显性突变分离的家系和SSBP1基因和蛋白质上2个改变残基的定位。
(A类)显示携带致病性c.113G>A变异体（家族A和B）或c.320G>A（家族c、D和E）的家族男性（方形）和女性（圆形）的谱系SSBP1型基因。黑色符号表示受影响的家族成员，白色符号表示未受影响的家庭成员。指出了每个被分析家族成员的突变状态。(B类)A族（左侧面板）和D族（右侧面板）基因组DNA测序的电泳图。显示WT和突变（Mut）等位基因。所有患者均为已鉴定突变的杂合子。(C类)序列比对显示不同物种间受影响的2个氨基酸残基的保守性。(天)人类SSBP1（基因位于顶部，蛋白质位于底部）的示意图，以及2个突变的定位。红色方块代表外显子，显示了与线粒体转运结构域（蓝色）和DNA结合结构域（绿色）相对应的区域。
图2
图2。SSBP1患者的临床特征。
A家族个体VI-25合并视神经萎缩和视神经病变(A类)右眼眼底照片和(B类)左眼。注意对称的颞叶视盘苍白（黑色箭头）。(C类)光学SD-OCT和视网膜神经纤维层（RNFL）偏差图证实，颞叶RNFL厚度显著降低。时间部分厚度超出正常限值（红色）。绿色区域对应第5–95个百分位，黄色区域对应第1–5个百分位数，红色区域对应低于第1个百分位点。外径，右眼；OS，左眼。(天)右眼SD-OCT黄斑分析(E类)左眼受伤。SD-OCT显示了一种在彩色照片上未被发现的合并黄斑病变。在中央凹下方的双眼（蓝色箭头）中观察到椭球线和叉指线的微小断裂。
图3
图3。人视网膜和成纤维细胞中SSBP1蛋白的表达。
(A类)人视网膜中SSBP1蛋白的表达。对健康人供体视网膜横截面进行免疫荧光标记。添加Hoechst标记细胞核（蓝色）。使用特定抗体（绿色）进行SSBP1定位。抗ATP合成酶亚单位5A的抗体用于靶向线粒体（红色）。视网膜色素上皮；POS，光感受器外段；ONL，外核层；INL，内核层；GCL，神经节细胞层。比例尺：20μm。(B类)对照组和受影响个体（患者1、患者2和患者3）培养的皮肤成纤维细胞中SSBP1转录水平的量化。mRNA水平标准化为参考基因L27型. (C类)对照组（对照组1和对照组2）和患者成纤维细胞裂解液中的Western blot和对照组和患者成细胞细胞裂解液SSBP1蛋白丰度的密度分析。GAPDH被用作负荷控制。数据显示为平均值±SEM***P（P）< 0.001. (天)透射电镜观察对照组（C1、C2）和患者成纤维细胞线粒体的典型超微结构。比例尺：1μm。单箭头表示线粒体异常。双箭头表示脂滴。对照组和患者成纤维细胞中异常线粒体（大液泡、嵴紊乱）的定量分析。数据表示为异常线粒体在总检查线粒体中的平均百分比±SEM**P（P）< 0.01. 所有数据均代表3个独立实验。使用了带有Dunnett校正的单向方差分析。
图4
图4。SSBP1突变的结构效应。
(A类)SSBP1的晶体结构表明，人类SSBP1由二聚体（分子molA和molB）组成，二聚体与第二个对称相关的二聚体接触，形成四聚体生物单元。Arg38和Arg107均显示为黄色（框架）。(B类)突变残基的放大；Arg38替换为Gln38（顶部）。底部面板相同，只是Arg107被Gln 107替换。在每种情况下，突变的残基都显示为浅灰色。(C类)对照组（对照组1和对照组2）和患者成纤维细胞（患者1、患者2、患者3）中SSBP1单体和二聚体的SDS/PAGE分析。肌动蛋白被用作加载控制。对于每个细胞系，加载3个独立的生物重复。(天)合并对照组和患者成纤维细胞中SSBP1单体（左）和二聚体（右）的密度定量。数据显示为散点图，并显示平均值±SEM**P（P）< 0.01; ***P（P）<0.001，带Dunnett校正的单因素方差分析。请注意，一些相同的样品（对照组1、患者1和患者2）在两种膜上运行，因此这些代表技术复制品。在统计分析之前，取两种膜的肌动蛋白比率的平均值。
图5
图5。SSBP1突变对线粒体DNA复制的功能影响。
(A类)线粒体DNA定量。通过qPCR测量mtDNA含量，并将对照组和患者成纤维细胞（患者1、患者2、患者3）中的mtDNA含量归一化为核基因（β-血红蛋白）。(B类)在对照组和患者成纤维细胞中，使用ATPsynthase抗体（绿色）和DNA抗体（mtDNA，红色）显示的线粒体核仁对线粒体进行典型共焦成像。比例尺：15μm。(C类)合并对照组和患者成纤维细胞中mtDNA核仁面积和体积的量化。(天)对来自对照和患者1的培养的皮肤成纤维细胞的mtDNA复制效率的评估。EdU标记用于检测和量化mtDNA合成，而抗DNA抗体用于量化所有可见的mtDNA病灶。对对照组和3个患者细胞系中的EdU和总mtDNA病灶进行计数，并汇总进行统计分析。比例尺：10μm(E类)对照组和患者mtDNA复制率的量化。数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; **P（P）<0.001未配对t吨测试。(F类)对照组和患者血液（左）和尿液（右）中mtDNA的突变率。所有数据均代表3个独立实验。曼·希特尼单位使用了测试。
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