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.2019年9月13日；15（9）：e1008368。
doi:10.1371/journal.pgen.1008368。 eCollection 2019年9月。

端粒功能障碍通过干扰BMP/pSmad/P63信号传导而损害表皮干细胞的规格和分化

刘娜（Na Liu） 1 2 3, 于茵 1 4, 王海英（Haiying Wang） 1, 周忠成 1, 盛晓燕（Xiaoyan Sheng） 1, 海丰付 1, 郭仁鹏 1, 王华（Hua Wang） 1, 焦阳 1, 彭功 1, 文宁 1, 振宇居 5, 刘一飞 6, 林刘（Lin Liu） 1 2
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端粒功能障碍通过干扰BMP/pSmad/P63信号传导而损害表皮干细胞的规格和分化

刘娜（Na Liu）等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

端粒缩短与衰老和年龄相关疾病有关。此外，端粒酶基因突变导致的端粒功能障碍可能导致过早衰老，例如明显的皮肤萎缩和脱发。然而，将端粒功能障碍与皮肤萎缩联系起来的分子信号尚不明确。在这里，我们发现功能失调的端粒破坏了BMP/pSmad/P63信号传导，损害了表皮干细胞的规格以及皮肤和毛囊的分化。我们发现，在ESC分化模型以及端粒缩短小鼠的成年发育中，由Terc丢失介导的端粒缩短上调卵泡抑素（Fst），抑制pSmad信号传导，下调P63和表皮角蛋白。从机制上讲，短端粒破坏了PRC2/H3K27me3介导的Fst抑制。我们的研究结果表明，端粒功能障碍导致的皮肤萎缩是由之前未被认可的Fst和BMP信号引起的，这可以在治疗的发展中进行探索。

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图1
图1。短端粒损害ES细胞向表皮细胞系的分化在体外.
（A） 产生G1、G3、G4的育种策略Terc公司–/–并从相应的小鼠中分离出其ES细胞系。使用的ES细胞系包括WT ES细胞（N33），Terc公司+/-ES细胞（H1）、G1（F19）、G3（F35）和G4（A49）Terc公司–/–端粒从长到短的ES细胞。（B） 的示意图在体外ES细胞分化方案。ES细胞在无LIF悬滴培养基中培养4天，然后转移到微孔板上培养11天。在分化后的第0天、第8天和第15天收集样本进行各种分析。（C） 端粒长度显示为T/S比率和相对表达水平泰特和Terc公司在分化第0天、第4天和第15天通过实时qPCR进行分析。条形图=平均值±SEM（n=4）。**，与同一时间点的WT ES细胞相比，p＜0.01，***，p＜0.001。（D） 分化第0天和第15天ES细胞的Southern blot分析显示端粒长度分布为TRF。（E） 分化第15天，通过Western blot分析验证具有不同端粒长度的ES细胞中表皮（K14和P63）、神经外胚层（βIII-Tubulin）、中胚层（α-Sma）和内胚层（Afp）标记物的蛋白质水平。β-actin作为负荷控制。（F） 分化第15天表皮标记物K14和P63的免疫荧光，显示G4中K14和P63表达缺陷的区域Terc公司–/–细胞，与WT细胞相比。比例尺=20μm。（G） G4分化第15天时神经外胚层（βIII-Tubulin）、中胚层（α-Sma）和内胚层（Afp）标记物的免疫荧光Terc公司–/–细胞和WT细胞。比例尺=50μm。胚胎干细胞；野生型；K14、角蛋白14。
图2
图2。短端粒损害表皮分化体内.
（A） WT和G4形成的畸胎瘤H&E染色后组织学显示的三个胚胎胚层Terc公司–/–ES细胞。比例尺=50μm。（B） WT和G4畸胎瘤表皮标志物K14和核P63的免疫荧光研究Terc公司–/–ES细胞。细胞核被Hoechst染成蓝色。比例尺=50μm。（C） 基底层标记的qPCR表达水平K14号公路和第63页在WT和G4形成的畸胎瘤中Terc公司–/–ES细胞。条形图=平均值±SEM（n=3）。*，p<0.05；**，与WT畸胎瘤相比，p<0.01。（D） 在小鼠皮肤表皮切片中显示P63与K14共染色的典型免疫荧光图像。WT小鼠皮肤下面和G3显示许多毛囊Terc公司–/–小鼠皮肤上的毛囊越来越少，越来越小。比例尺=25μm。（E） WT和G3中的毛囊数Terc公司–/–每场鼠标皮肤视图。统计了10个视野，**，p<0.01。（F） 显示WT和G3皮肤（背部）的典型图像Terc公司–/–K14和P63免疫荧光和H&E染色组织学显示小鼠。比例尺=20μm。（G） WT和G3皮肤表皮厚度Terc公司–/–根据H&E组织学评估的小鼠。*，p<0.05。
图3
图3。端粒长度调节Fst/BMP/pSmad信号。
（A） 显示WT和G4全球差异基因表达谱的散点图Terc公司–/–ES细胞。用至少1.8倍的变化作为差异表达基因的截止值。G4中的红色上调基因和绿色下调基因Terc公司–/–细胞相对于WT细胞。两个轴（对数10scale）表示重复序列的平均归一化基因表达值。（B）前通过qPCR测定ES细胞系的表达水平，归一化为Gapdh公司表达为与WT ES细胞的相对表达。条形图=平均值±SEM（n=3）。*，p<0.05。（C） western blot分析ES细胞分化第0天、第8天和第15天的Fst蛋白水平。细胞内β-actin水平作为负荷控制。（D） 免疫荧光显微镜显示ES细胞和分化细胞中Fst（红色）的表达以及与K14（绿色）或P63（绿色）的联合染色。Fst分布在细胞内部和周围，在G4中表达水平较高Terc公司–/–与WT细胞相比，ES细胞核P63和细胞质或膜K14的表达减少以及分化后呈负相关。细胞核用Hoechst 33342染成蓝色。比例尺=20μm。（E） Western blot检测与WT分化的畸胎瘤中Fst蛋白水平，Terc公司+/–、G1和G4Terc公司–/–ES细胞。（F） WT和G4畸胎瘤中K14（绿色）和Fst（红色）的免疫荧光Terc公司–/–ES细胞。比例尺=50μm。（G） 在畸胎瘤切片中显示P63（绿色）和Fst（红色）共染色的典型免疫荧光图像。比例尺=50μm。（H） 通过western blot分析分化过程中Smad和pSmad的蛋白质水平。细胞内β-actin水平作为负荷控制。Fst，卵泡抑素；BMP，骨形态发生蛋白。
图4
图4。Fst抑制pSmad、P63和K14。
（A） 通过qPCR的相对表达水平前WT ES细胞分化过程中稳定过度表达前（OE），与转染空载体的WT ES细胞作对照（Con）。条形图=平均值±SEM（n=3）。（B） Western blot检测Fst、Smad、pSmad、P63和K14蛋白水平前与对照组相比，ES细胞过度表达。右侧面板，使用ImageJ软件量化蛋白质水平，归一化为β-actin.*，p<0.05；**，p<0.01***与对照组相比，p<0.001。（C） 的过度表达（OE）前通过免疫荧光显微镜观察，ES细胞中P63和K14的表达降低。虽然转染构建物Plch37的WT ES细胞仅在低水平上作为对照表达Fst，但ES细胞稳定过度表达前通过免疫荧光显微镜在更高水平上表达Fst。ES细胞分化后过度表达前与Plch37质粒对照相比，细胞质K14和细胞核P63的免疫荧光染色显著降低。比例尺=20μm。（D&E）拆除前在G4中Terc公司–/–分化第15天的细胞导致第63页qPCR（D）检测，Western blot（E）检测pSmad1/5/8和P63蛋白水平升高。右侧面板，使用ImageJ软件量化蛋白质水平，标准化为β-actin.*，p<0.05；**，p<0.01***与WT相比，p<0.001。T1和T3是两个独立的靶向干扰RNA序列前.
图5
图5。的修复Terc公司恢复端粒并部分恢复Fst/P63信号。
（A） 的表达式级别Terc公司之后通过实时qPCRTerc公司修理。***，P<0.001。（B） 后实时qPCR显示端粒相对长度为T/S比Terc公司修理。*，p<0.05；**，p<0.01。（C） 端粒定量FISH图像和直方图显示了作为端粒荧光强度单位（TFU）的相对端粒长度分布。n=每个细胞系分析10–15个扩散。红色箭头表示端粒丢失或染色体融合。红线表示端粒长度中等。（D） TRAP法测定端粒酶活性。溶血缓冲液用作阴性对照。（E） 通过蛋白质印迹分析P63和K14的蛋白质水平Terc公司分化第15天修复细胞。β-actin作为负荷控制。（F&G）野生型ES细胞分化第15天K14和P63（F），或Fst和K14（G）的免疫荧光，G4Terc公司–/–ES细胞，以及Terc公司-修复的G4Terc公司–/–ES细胞。
图6
图6。前受表观遗传修饰调控。
（A） G4中端粒无信号末端的频率与13号染色体的融合Terc公司–/–ES细胞，与WT ES细胞相比。PNA探针的端粒FISH和WT和G4的XMP13探针的染色体鉴定Terc公司–/–ES细胞。箭头表示用XMP13染色的13号染色体。Chr13A和Chr13B是同一排列中的一对13号染色体。端粒缺失前WT和G4之间13号染色体的基因位点和融合比较Terc公司–/–ES细胞。（B） ChIP-qPCR分析H3K9me3、H3K9 me2、H3K9Ac和H3K27me3的丰度前WT和G4的启动子位点Terc公司–/–ES细胞。平均值±SEM（n=3）。*，p<0.05；**，p＜0.01。（C） 一个简化模型显示了Fst/BMP4-Smad/P63信号的端粒长度在表皮干细胞分化和分化中的调节。具有功能性端粒，PRC2/H3K27me3在前启动子灶抑制前在表皮和毛囊的规范和分化中，保持正常的BMP4-Smad信号和P63和角蛋白（例如K14）的适当表达水平。在端粒缩短或丢失的情况下，H3K27me3在前病灶减少，这导致前，它损害BMP4-pSmad信号，从而降低P63和K14的表达、表皮干细胞的规格和分化。
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