The molecular basis of chaperone-mediated interleukin 23 assembly control

doi:10.1038/s41467-019-12006-x

.2019年9月11日；10(1):4121.

doi:10.1038/s41467-019-12006-x。

伴侣介导白细胞介素23组装调控的分子基础

附属公司

¹慕尼黑理工大学化学系慕尼黑综合蛋白质科学中心（CIPSM）。4，85748，加兴，德国。
²慕尼黑技术大学过敏与环境中心（ZAUM）和德国慕尼黑Biedersteiner Str.29，80802 Helmholtz Zentrum München。
^三慕尼黑亥姆霍兹中心结构生物学研究所。1，85764，Neuherberg，Germany德国。
⁴斯坦福大学生物工程系，443 Via Ortega，Stanford，CA，94305，USA。
⁵慕尼黑理工大学化学系慕尼黑综合蛋白质科学中心（CIPSM）。4，85748，加兴，德国。matthias.feige@tum.de。
⁶慕尼黑理工大学高级研究所。2a，85748，加兴，德国。matthias.feige@tum.de。

PMID： 31511508
预防性维修识别码： PMC6739322型
内政部： 10.1038/s41467-019-12006-x

伴侣介导白细胞介素23组装调控的分子基础

苏珊·迈尔等。国家公社. 2019.

.2019年9月11日；10(1):4121.

doi:10.1038/s41467-019-12006-x。

附属公司

¹慕尼黑理工大学化学系慕尼黑综合蛋白质科学中心（CIPSM）。4，85748，加兴，德国。
²慕尼黑技术大学过敏与环境中心（ZAUM）和德国慕尼黑Biedersteiner Str.29，80802 Helmholtz Zentrum München。
^三慕尼黑亥姆霍兹中心结构生物学研究所。185764，德国诺伊赫贝格。
⁴斯坦福大学生物工程系，443 Via Ortega，Stanford，CA，94305，USA。
⁵慕尼黑理工大学化学系慕尼黑综合蛋白质科学中心（CIPSM）。4，85748，加兴，德国。matthias.feige@tum.de。
⁶慕尼黑理工大学高级研究所。2a，85748，加兴，德国。matthias.feige@tum.de。

PMID： 31511508
预防性维修识别码： PMC6739322型
内政部： 10.1038/s41467-019-12006-x

摘要

大多数分泌蛋白的功能取决于它们组装成一个确定的四元结构。尽管如此，尚不清楚细胞是如何将未组装的蛋白质从需要降解的错误折叠的蛋白质中区分出来，从而达到天然状态的。在这里，我们以白细胞介素23（IL-23）为模型，展示伴侣如何调节和控制异二聚体蛋白的组装。我们发现，IL-23α亚基在与其β亚基发生组装之前保持部分非结构化，并确定了不完全折叠的主要部位。不完全折叠被分泌途径上的不同伴侣识别，通过顺序检查点实现可靠的组装控制。伴侣识别位点的结构优化允许其绕过质量控制检查点，并提供分泌型IL-23α亚单位，该亚单位仍能形成功能性异二聚体IL-23。因此，单域蛋白质中的局部限制性不完全折叠可用于调节和控制其组装。

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图1
在缺乏IL-12β的情况下，细胞中IL-23α发生错误折叠。一异二聚体IL-23的结构。形成分子间二硫键的IL-23α（蓝色）和IL-12β（灰色）中的半胱氨酸显示为黄色。b条FLAG标记野生型IL-23α（IL-23^重量)无论是否存在其相互作用伙伴IL-12β。Hsc70用作加载控制。**c（c）**IL-23α在隔离状态下形成非天然二硫键（通道3），IL-12β与IL-23β共价异二聚体（通道4和5），同时减少IL-23 a的错误折叠。样品在细胞中用β-Me裂解后/DTT处理以在指示的情况下进行还原，并用NEM处理以保存氧化还原物种。d日IL-23α的结构。在IL-23α中形成分子内二硫键的半胱氨酸以红色显示，与IL-12β结合的半胱酶以黄色突出显示，游离半胱氨酸则以橙色显示。**e（电子）**IL-23α（蓝色）、IL-6（青色）和IL-12α（浅灰色）的结构对齐。保守的二硫键显示为红色，与IL-23α和IL-12α的自由半胱氨酸结合的IL-12β显示为黄色。如果IL-23α、IL-6和IL-12α的模型，显示半胱氨酸和二硫键。颜色代码与中的相同**日期：，** **e（电子）**已使用。编号没有信号序列。克FLAG标记的IL-23α结构体的分泌行为b条但带有指示的IL-23α半胱氨酸突变体

图2
IL-23α中的半胱氨酸被ER伴侣识别并影响其半衰期。一IL-23α降解的时间过程^重量，IL-23α^C58,70秒，IL-23α^C54S汽车和IL-23α^14.22伏与环己酰亚胺（CHX）的转化抑制达180 最小Hsc70用作负载控制。右图：蛋白质周转的量化显示；数据是至少四个独立实验的平均值±SEM。源数据作为源数据文件提供。b条FLAG-标记IL-23α联合免疫沉淀共转染仓鼠BiP或内源性ERp44的免疫印迹分析^重量，IL-23α^C58,70秒，IL-23α^C54S汽车和IL-23α^14.22伏中心和右侧：通过至少七个独立实验（显示为±SEM）确定相对结合，并将其归一化为IL-23α^重量信号，设置为100%相对绑定。使用双尾非配对方法计算统计显著性t吨-测试。纳秒 = 不显著*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001表示存在统计显著性差异。IL-23α^C58,70岁construct在蛋白质和标签之间有一个较短的连接子，这解释了它的迁移速度稍快的原因。**c（c）**FLAG标记IL-23α的分泌行为^{C14,22V，C54S}无论是否存在IL-12β。Hsc70用作装载控制

图3
IL-23α中的螺旋1在与IL-12β组装后获得结构。一IL-23α的远紫外CD光谱^VVS公司.b条IL-23α^VVS公司以48的熔化温度协同展开 ± 0.2 摄氏度。**c（c）** ¹H、，¹⁵IL-23α的N HSQC核磁共振谱^VVS公司; 插图以缩放视图显示了向下场移动的色氨酸吲哚侧链信号。d日氢/氘交换（HDX）实验显示IL-23α中的螺旋1^VVS公司高度灵活，与IL-12β相互作用后稳定。IL-23α根据测量的HDX速率着色。蓝色对应较低（不太灵活的区域），红色对应较高（灵活区域）的摄取分数（灰色：HDX测量中无序列覆盖）。**e（电子）**所示为浅蓝色和半胱氨酸残基中IL-23α（蓝色）与螺旋1的结构，使用与图1d相同的色码，并与IL-12β（灰色）复合。Trp残留物以绿色显示。如果Trp吲哚侧链信号¹H、，¹⁵IL-23α的N HSQC实验^VVS公司通过分析IL-23α的光谱，从两个次要信号中获得了明确的W26赋值^VVS、W26F（绿色，缩放视图）和额外的IL-23α^VVS，W11F变种（蓝色，缩放视图）。IL-23α的光谱强度^VVS、W26F较低，因此增加了两倍，以便进行比较。克等同于如果但对于未配对IL-23α^VVS车辆（黑色）与IL-23α^VVS公司存在两倍摩尔过量的未标记IL-12ß（红色）。IL-23α与IL-12β结合的光谱强度增加，以补偿复合物分子量的增加。两次测量都使用了相同的实验参数

图4
螺旋1的优化使IL-23α能够通过内质网质量控制。一IL-23α螺旋1优化。顶部：IL-23α的结构，优化区域以绿色突出显示。底部：IL-23α的6–22氨基酸序列比较^重量和IL-23α^选择IL-23α中的氨基酸交换^选择以红色突出显示。b条FLAG标记IL-23α的分泌行为^选择在有无IL-12β的情况下。Hsc70用作加载控制。**c（c）**FLAG-标记IL-23α联合免疫沉淀共转染仓鼠BiP或内源性ERp44的免疫印迹分析^选择中心和右侧：至少为四个独立实验（显示为±SEM）计算每个带的相对强度，并将其归一化为IL-23α^重量信号设置为100%。使用双尾非配对方法计算统计显著性t吨-测试***第页 < 0.001表示存在统计显著性差异。d日IL-23α的远紫外CD光谱^选择.e（电子）IL-23α^选择以61的熔化温度展开 ± 0.7 摄氏度。如果未配对IL-23α的氢/氘交换（HDX）实验^选择与IL-12β相比-配对IL-23^选择IL-23α^选择根据测量的HDX速率着色。蓝色对应较低（不太灵活的区域），红色对应较高（灵活区域）的摄取分数（灰色：HDX测量中无序列覆盖）

图5
细胞内IL-23组装控制模型。IL-23α的不完全折叠^重量由分泌途径上的伴侣识别。IL-23α的结构是不完全的，尤其是其四个螺旋中的第一个，可以在内质网内的早期生物发生步骤中被BiP识别。ERp44是PDI家族的成员，通过从ERGIC室检索IL-23 a到内质网来支持BiP功能，从而作用于BiP的下游。BiP和ERp44共同作用，维持IL-23α的装配能力。在与IL-12β组装后，IL-23α完成其第一螺旋的折叠，从而抑制伴侣相互作用并导致分泌由二硫键连接的异二聚体IL-23复合物。如果IL-23α不能正确组装，它就会被靶向ER相关降解（ERAD）。IL-23α中存在游离半胱氨酸可减缓ERAD，因此很可能是通过伴侣结合。第一螺旋的稳定使IL-23α对伴侣相互作用不敏感，并允许独立折叠和分泌。尽管有独立分泌，IL-23α^选择仍然能够与IL-12β相互作用。IL-23诱导受体结合的强信号传导，而IL-23α^选择显示弱受体激活。IL-23α结构内的环以虚线表示

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1. Krogan NJ等。酿酒酵母中蛋白质复合物的全球景观。自然。2006;440:637–643. doi:10.1038/nature04670。-内政部-公共医学
1. Gavin AC等。蛋白质组调查揭示了酵母细胞机制的模块性。自然。2006;440:631–636. doi:10.1038/nature04532。-内政部-公共医学
1. Balchin D、Hayer-Hartl M、Hartl FU。蛋白质折叠和质量控制的体内方面。科学。2016;353:aac4354。doi:10.1126/science.aac4354。-内政部-公共医学
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[1] Havugimana PC等人，《人类可溶性蛋白质复合物普查》。单元格。2012;150:1068–1081. doi:10.1016/j.cell.2012.08.011。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[3] Krogan NJ等。酿酒酵母中蛋白质复合物的全球景观。自然。2006;440:637–643. doi:10.1038/nature04670。-内政部-公共医学

[4] Krogan NJ等。酿酒酵母中蛋白质复合物的全球景观。自然。2006;440:637–643. doi:10.1038/nature04670。-内政部-公共医学

[5] Gavin AC等。蛋白质组调查揭示了酵母细胞机制的模块性。自然。2006;440:631–636. doi:10.1038/nature04532。-内政部-公共医学

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[9] Juszkiewicz S，Hegde RS。孤儿蛋白的质量控制。分子细胞。2018;71:443–457. doi:10.1016/j.molcel.2018.07.001。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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