跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2019年12月；25(12):1731-1750.
doi:10.1261/rna.072454.119。 Epub 2019年9月11日。

融合癌基因的HNRNPH1依赖性剪接揭示了靶向RNA G-四链体相互作用

卡拉领口 1, 罗伯特·E·波尔 2, 尼古拉斯·阿伯丁 1, Allison M Cross公司 1, 罗伯特·L·沃克 三, Bong-Hyun Kim（金凤贤） 4, Suntae Kim先生 1, John S Schneekloth Jr 2, 娜塔莎·J·卡普伦 1
附属公司

融合癌基因的HNRNPH1依赖性剪接揭示了靶向RNA G-四链体相互作用

卡拉领口等。 核糖核酸. 2019年12月.

摘要

约85%的尤因肉瘤的主要致癌事件是染色体易位，产生编码异常转录因子的融合癌基因。易位基因中的确切基因组断点，EWSR1号机组和FLI1、，变化；然而，在EWSR1，断点通常出现在内含子7或8中。我们之前发现在尤因肉瘤细胞中EWSR1号机组内含子8断点，RNA结合蛋白HNRNPH1促进剪接事件EWSR1号机组第8外显子预警系统-FLI1公司前mRNA生成框架内mRNA。在这里，我们表明预警系统-FLI1公司HNRNPH1的前mRNAs，而不是其他同源家族成员，类似于EWSR1型我们证明HNRNPH1的招募是由体内富含鸟嘌呤的序列驱动的EWSR1号机组外显子8有可能折叠成RNA G-四倍体结构。关键的是，我们证明了其中一个G-四链体的RNA模拟物调节HNRNPH1结合并诱导细胞生长减少EWSR1号机组外显子8融合阳性的尤因肉瘤细胞系。最后，我们证明EWSR1号机组外显子8融合阳性细胞系对泛四链结合分子吡陀司他丁（PDS）的治疗比EWSR1号机组外显子8融合阴性株。此外EWSR1号机组带有PDS的外显子8融合阳性细胞降低EWS-FLI1的转录活性，逆转EWS-FLI导致的转录解除调控。我们的研究结果表明EWS-飞行1pre-mRNA是一种新的治疗策略EWSR1号机组第8外显子包含融合癌基因，存在于三分之一的尤因肉瘤中。

关键词：EWSR1；EWS–FLI1；尤因肉瘤；G-四联体；HNRNPH1；拼接。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
HNRNPH1介导的EWSR1号机组第8外显子含有前mRNA。(A类)qPCR评估EWS–第1层,EWSR1型,HNRNPH1、HNRNPH2、和HNRNPF公司mRNA表达HNRNPH1号机组,HNRNPH2号机组，或HNRNPF公司沉默TC32 EWS细胞（48小时）。数据被归一化为参考基因的地理平均值，ACTB公司,RPL27型、和NACA公司，并相对于siNeg转染细胞表达（平均值±SEM，n个= 3). (**)P（P）< 0.01; (***)P（P）与siNeg转染的细胞相比，<0.001。有关其他实验细节，请参阅补充表S7. (B类)所选的表达式EWSR1号机组和EWS–第1层利用剪接连接分析对靶向RNA-seq数据中的外显子-外显子连接进行分析HNRNPH1号机组-沉默的HEK-293T细胞(顶部图）和TC32 EWS单元(底部图表）。数据是相对于siNeg转染细胞（48 h，平均值±SEM，n个= 3). (C类)假设的HNRNPH1依赖调节的示意图EWSR1号机组第8外显子含有前mRNA。
图2。
图2。
HNRNPH1结合位点rG1的鉴定EWSR1号机组第8外显子。(A类)的3′端序列EWSR1号机组外显子8(顶部)以及与该外显子对应的一系列3′-生物素化RNA寡聚体的序列(底部). (B类)3′-生物素化EMSA化学发光凝胶EWSR1号机组第8外显子RNA寡聚体，如(A类)在不存在或存在纯化的HNRNPH1蛋白的情况下。箭头表示每个标记探针的移动性变化。(C类)基于抗体的RNA低聚物结合分析的示意图。(D类)通过比较使用HNRNPH1抗体和IgG同型对照进行下拉的化学发光信号，确定HNRNPH1-bounded RNA低聚物的折叠富集。数据显示为三个技术复制品的平均值±SEM。(***)P（P）< 0.001. 重组、纯化的HNRNPH1被用作蛋白源。(E类)TC32-NR0B1-luc和TC32-CMV-luc报告子的比率在所述siRNA（20 nM）或所示浓度的合成RNA低聚物转染72小时后发出信号。将数据归一化为对照，siNeg（平均归一化，±SEM，n个= 4). (*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01; (***)P（P）与siNeg相比<0.001。(F类)EWS细胞系TC32的相对活力(顶部面板）和TC71(底部面板）在所述siRNA（20 nM）或所示浓度的合成RNA低聚物转染72 h后。将数据归一化为对照，siNeg（平均归一化，±SEM，n个= 4). (*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01; (***)P（P）与siNeg相比<0.001。(克)qPCR评估EWS–第1层siRNA或合成RNA低聚物转染的TC32 EWS细胞中的mRNA表达（48小时）。数据被标准化为参考基因NACA公司并相对于未处理的细胞表达（平均值±SEM，n个= 3). (*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01; (***)P（P）与未经处理的细胞相比<0.001。有关其他实验细节，请参阅补充表S7. (H（H）)使用针对所述蛋白质的抗体对由siRNA或合成RNA寡聚物转染的TC32 EWS细胞制备的全细胞裂解物进行免疫印迹分析（48小时）。（UTR）未经处理的细胞。
图3。
图3。
HNRNPH1和rG1低聚物相互作用的特异性。(A类)用siRNA或合成的ssRNA寡聚体转染TC32细胞24小时，然后下拉链霉亲和素。HNRNPH1和rG1/rG1之间的相互作用mt1（百万吨）经HNRNPH1免疫印迹证实。（UTR）未经处理的细胞。(B类)用于3′-生物素化的化学发光EMSA凝胶EWSR1号机组外显子8 rG1和rG1mt1（百万吨）不同浓度的纯化HNRNPH1。楔形物表示纯化HNRNPH1的数量减少（20、10、5、2.5和1.25 nM）。箭头表示每个标记探针的移动性变化。(C类)通过比较使用HNRNPH1抗体和IgG同型对照进行的下拉化学发光信号，确定不同浓度非生物素化rG1下HNRNPH-结合rG1的折叠富集。数据显示为三个技术复制品的平均值±SEM。(D类)本研究中使用的HNRNPH1蛋白结构域示意图和一组重组His标记的HNRNFH1结构域。所有领域注释均改编自Van Dusen等人（2010）。使用领域图（DOG）2.0版构建原理图（Ren等人，2009）。(E类)显示了全长HNRNPH1蛋白通过SPR与rG1 RNA靶表面的结合。黑线表示HNRNPH1在每个传感器图上指示浓度下的结合反应。HNRNPH1暴露于表面2分钟（结合阶段），然后流动缓冲液10分钟（分离阶段）。将数据全局拟合到1:1绑定模型，各拟合以红色显示。得到的参数值如表1所示。(F类)全长HNRNPH1蛋白与rG1的结合mt1（百万吨）显示了SPR的RNA靶表面。黑线表示HNRNPH1在15.6、31.3、62.5和125 nM时的结合反应。HNRNPH1暴露于表面，如E类; 然而，没有观察到结合。
图4。
图4。
HNRNPH1直接与非结构G-tracts和RNA G-traplex结构结合EWSR1型外显子8 rG1。(A类)荧光强度增强(F类/F类0)在含有20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM KCl、25°C的缓冲液中，以440/487 nm的激发和发射波长，在6µM硫黄素T和2µM RNA中对所示RNA寡聚体进行检测。(***)P（P）< 0.001. (B类)3′-生物素化物的平滑圆二色光谱EWSR1号机组外显子8 rG1或rG1mt1（百万吨）25°C下，在含有20 mM Tris-HCl、pH 7.5且不添加盐、150 mM LiCl或150 mM KCl的缓冲液中的低聚物（10µM）。(C类)生物素化EMSA化学发光凝胶EWSR1型外显子8 rG1和rG1mt1（百万吨）在25°C的不同盐条件下，在无BG4抗体和有BG4抗体的情况下，在20 mM Tris-HCl（pH 7.5）中培养。箭头表示每个标记探针的迁移率变化。(D类)平滑CD熔化曲线EWSR1号机组外显子8 rG1（25µM），位于含有20 mM Tris-HCl pH 7.5和150 mM KCl的缓冲液中。(E类)使用生物素化的四倍体特异性抗体测定折叠富集EWSR1号机组外显子8 rG1和rG1月1日在25°C的不同盐条件下，在20 mM Tris-HCl（pH 7.5）中，使用BG4抗体和IgG1同型控制通过化学发光信号的变化来确定。数据显示为三个技术复制品的平均值±SEM。ns，不显著；(***)P（P）< 0.001. (F类)生物素化EMSA化学发光凝胶EWSR1号机组外显子8 rG1和rG1mt1（百万吨）在25°C的不同盐条件下，在pH 7.5的20 mM Tris HCl中，在无纯化HNRNPH1和有纯化HNRNFH1的情况下培养。箭头表示每个标记探针的迁移率变化。(克)在30 nM HNRNPH1和不同浓度的BG4抗体下获得的rG1–HNRNPH2（黑色）和rG1-BG4（红色）免疫复合物的折叠富集图。数据显示为三个技术复制品的平均值±SEM。(H（H）)在0.5 nM BG4抗体和不同浓度的HNRNPH1下获得的rG1–HNRNPH2（黑色）和rG1-BG4（红色）免疫复合物的折叠富集图。数据显示为三个技术复制品的平均值±SEM。
图5。
图5。
RNA G-四链体区域的一个亚群在人类基因组中HNRNPH1结合位点附近富集。(A类)覆盖范围图(左边)并阅读密度热图(正确的)表示RNA G-四链体位点附近指示hnRNP的结合读取计数（±1 Kb）。每个hnRNP的RNA靶点和结合位点均来自iCLIP或eCLIP数据集（Uren等人2016；Van Nostrand等人2016）。RNA G-四链体位点是从测序数据集GSE77282中获得的（Kwok等人，2016年）。(B类)HNRNPH1结合位点的过度表达序列模体，与最高标记的1500个RNA鸟嘌呤四链体区域（组合成500组）或包含潜在RNA鸟嘌酰胺四链体的所有外显子区域重叠。
图6。
图6。
PDS与rG1相互作用，选择性抑制携带EWSR1型外显子8融合转录本。(A类)5′-Alexa Fluor 647标记物的PDS诱导荧光猝灭EWSR1号机组外显子8 rG1寡聚体。(B类)通过比较使用HNRNPH1抗体和IgG同型对照进行的下拉化学发光信号，确定不同PDS浓度下HNRNPH-结合rG1的折叠富集。TC32全细胞裂解物中的HNRNPH1被用作蛋白源。(C类)EWS细胞系（TC32、SKNMC、RD-ES和TC71）在不同浓度的吡陀司他丁标准化为对照，0.1%二甲基亚砜（平均标准化，±SEM，n个= 6). (D类)非EWS细胞系（HCT116、PC3和HEK-293T）在不同浓度的吡陀司他丁标准化为对照，0.1%二甲基亚砜（平均标准化，±SEM，n个= 6). (E类)使用用指示浓度的吡陀司他丁预处理72 h，然后在无化合物培养基中培养7 d的细胞进行集落形成分析。我们使用Celigo微孔图像细胞仪对菌落进行成像和计数（平均归一化，±SEM，n个= 4). 平板上的菌落呈假绿色。(*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01; (***)P（P）与0.1%二甲基亚砜对照组相比<0.001。（CI）置信区间，（UTR）未处理细胞。
图7。
图7。
在TC32细胞中，PDS调节EWS–第1层mRNA处理，降低EWS-FLI1蛋白水平，恢复EWS-FLI解除调控靶点的mRNA表达。(A类)qPCR评估HNRNPH1号机组和EWS–第1层PDS处理或siRNA转染TC32 EWS细胞中的mRNA表达（48小时）。数据被归一化为参考基因的地理平均值，ACTB公司和RPL27型，并且相对于未处理的细胞表达（平均值±SEM，n个= 3). (*)P（P）< 0.05; (**)P（P）与未经处理的细胞相比，<0.01。有关其他实验细节，请参阅补充表S7. (B类)剪接的PCR分析EWS–第1层使用对应于的引物EWSR1号机组外显子7正向和FLI1公司PDS处理或siRNA转染TC32 EWS细胞的外显子7反向引物对（48小时）。箭头表示额外的PCR产物带。(C类)使用所示蛋白抗体对PDS处理或siRNA转染TC32细胞制备的全细胞裂解物进行免疫印迹分析（48小时）。(D类)TC32-NR0B1-luc和TC32-CMV-luc报告基因在不同浓度的吡陀司他丁标准化为对照组0.1%二甲基亚砜（平均标准化，±SEM，n个= 6). (E类)585/635 nm激发和发射波长下的相对荧光单位(顶部)和相位合流(底部)在TC32-NR0B1-m樱桃细胞中，不同浓度的吡陀司他丁归一化为对照，0.1%二甲基亚砜（48小时，平均归一化，±SEM，n个= 6). (*)P（P）< 0.05; (***)P（P）与对照组相比<0.001。(F类)PDS治疗中EWS–FLI1调节基因的qPCR评估(顶部)或HNRNPH1号机组-沉默(底部)TC32 EWS细胞（72小时）。数据标准化为ACTB公司相对于对照细胞、0.1%二甲基亚砜或siNeg转染细胞表达（平均值±SEM，n个= 3). (**)P（P）< 0.01; (***)P（P）与对照组相比<0.001。有关其他实验细节，请参阅补充表S7（CI）置信区间，（UTR）未处理细胞。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Alkan SA、Martincic K、Milcarek C.2006年。hnRNPs F和H2与类似序列结合以影响基因表达。生物化学J 393:361–371。10.1042/BJ20050538-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Arnott S，Chandrasekaran R，Marttila CM，1974年。聚肌苷酸和聚鸟苷酸的结构。《生物化学杂志》141:537–543。10.1042/bj1410537-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bailly RA、Bosselut R、Zucman J、Cormier F、Delatter O、Roussel M、Thomas G、Ghysdael J，1994年。尤文肉瘤t（11；22）易位产生的EWS-FLI-1融合蛋白的DNA结合和转录激活特性。分子细胞生物学14:3230–3241。10.1128/MCB.14.5.3230-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bhattacharyya D，Mirihana Arachchilage G，Basu S.2016年。G-四链折叠中的金属阳离子及其稳定性。前化学4:38 10.3389/fchem.2016.00038-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Biffi G、Tannahill D、McCafferty J、Balasubramanian S.，2013年。人类细胞DNA G-四链体结构的定量可视化。《自然化学》5:182–186。10.1038/立方厘米1548-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型