Mitofusins modulate the increase in mitochondrial length, bioenergetics and secretory phenotype in therapy-induced senescent melanoma cells

doi:10.1042/BCJ20190405

.2019年9月10日；476(17):2463-2486.

doi:10.1042/BCJ20190405。

丝裂霉素调节治疗诱导的衰老黑色素瘤细胞线粒体长度、生物能量和分泌表型的增加

附属公司

¹乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院生物研究中心（CEINBIO）和生物科学部。
²乌拉圭蒙得维的亚República大学医学院组织学和Embriología系。
^三乌拉圭蒙得维的亚巴斯德研究所细胞生物学室。
⁴乌拉圭蒙得维的亚巴斯德研究所代谢疾病和衰老实验室。
⁵乌拉圭蒙得维的亚共和国大学Ciencias学院电子传输大学。
⁶乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院Clínicas Manuel Quintela医院Cátedra de Dermatología。
⁷乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院Higiene研究所Desarrollo生物技术部疫苗研究实验室。
⁸乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院生物研究中心（CEINBIO）和生物科学部celiq@fmed.edu.uy celia.quijano@gmail.com。

PMID： 31431479
预防性维修识别码： PMC6735661型
内政部： 10.1042/BCJ20190405

丝裂霉素调节治疗诱导的衰老黑色素瘤细胞线粒体长度、生物能量和分泌表型的增加

詹尼弗·马丁内斯等。生物化学杂志. 2019.

.2019年9月10日；476(17):2463-2486.

doi:10.1042/BCJ20190405。

附属公司

¹乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院生物研究中心（CEINBIO）和生物科学部。
²乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院历史与教育部。
^三乌拉圭蒙得维的亚巴斯德研究所细胞生物学室。
⁴乌拉圭蒙得维的亚巴斯德研究所代谢疾病和衰老实验室。
⁵乌拉圭蒙得维的亚共和国大学Ciencias学院电子传输大学。
⁶乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院Clínicas Manuel Quintela医院Cátedra de Dermatología。
⁷乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院Higiene研究所Desarrollo生物技术部疫苗研究实验室。
⁸乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院生物研究中心（CEINBIO）和生物科学部celiq@fmed.edu.uy celia.quijano@gmail.com。

PMID： 31431479
预防性维修识别码： PMC6735661型
内政部： 10.1042/BCJ20190405

摘要

细胞衰老是化疗的终点，黑素瘤靶向治疗和衰老相关分泌表型（SASP）可以影响肿瘤生长和微环境，影响治疗结果。代谢干预可以调节SASP，线粒体能量代谢增强支持黑素瘤细胞对治疗的抵抗。在此，我们评估了将细胞暴露于甲基化化疗药物替莫唑胺（TMZ）后获得的治疗诱导的衰老黑色素瘤细胞的线粒体功能。黑色素瘤的衰老诱导伴随着线粒体基础呼吸率、ATP相关呼吸率、最大呼吸率、耦合效率、剩余呼吸能力和呼吸控制率的大幅增加。进一步检查显示线粒体质量和长度增加。通过细胞大小分类，在分离的衰老细胞中证实了线粒体功能和形态的改变。在衰老细胞中观察到丝裂原融合蛋白1和2（MFN1和2）的表达和水平增加，表明线粒体融合发生了变化。用短发夹RNA（shRNA）沉默丝裂原融合蛋白的表达，可以阻止黑素瘤衰老细胞中线粒体长度、耗氧速率和白细胞介素6（IL-6）分泌的增加，白细胞介导素6是SASP的一种成分。我们的结果代表了对黑素瘤治疗性衰老中线粒体功能的首次深入研究。它们表明衰老增加线粒体的质量、长度和能量代谢；并强调线粒体是调节衰老和SASP的潜在药理靶点。

关键词：生物能量学；细胞衰老；血液疗法；黑色素瘤；线粒体；丝裂原。

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利益冲突声明

作者声明，手稿不存在任何利益冲突。

数字

图1。 — **图1.TMZ诱导小鼠黑色素瘤细胞衰老。**
B16-F1细胞两次暴露于TMZ（200 µM）或车辆，DMSO（控制）5 h和24 h间隔。在第二次接触药物后的不同时间进行测量。(A类)用磷酸化ATM（Ser1981）（ATM-P）、ATM、磷酸化p53（Ser15）（p53-P），p53，p21和微管蛋白抗体进行的代表性蛋白质印迹(n个 = 每个条件3个培养皿）。(B类)TMZ治疗两天后γ-H2AX核病灶的典型图像。有核病灶的细胞百分比如下图所示(n个 = 每组6张盖玻片）。(C类)通过台盼蓝排除法计数活细胞获得生长曲线(n个 = 每组9口井）。(天)BrdU并入DNA的代表性图像。细胞核染色阳性的细胞百分比如下图所示(n个 = 每组6张盖玻片）。(E类)TMZ暴露四天后SA-β-gal活性测定的代表性图像。阳性细胞百分比如下图所示(n个 = 每组6口井）。(F类)治疗4天后用流式细胞仪检测细胞大小（FSC-H参数）和粒度（SSC-H参数。显示了具有代表性的图像(n个 = 每组3口井）。(**G公司**)根据补充图S1B中的直方图确定胰蛋白酶脱细胞的活细胞直径(n个 = 每组6个培养皿）。(**H（H）**)用双钦酸技术对胰蛋白酶脱细胞进行计数，并测定蛋白质质量（µg）(n个 = 每组3个培养皿）。(我)对SASP的几个成分进行实时RT-PCR。结果表示为相对于控制条件(n个 = 每组3个培养皿）。结果是平均值 ± S.D.公司。T型-进行了测试，*P（P） < 0.05,***P（P） < 0.0001.

图2。 — **图2.TMZ诱导的衰老细胞表现出线粒体呼吸增加。**
(A类)依次添加寡霉素、FCCP和抗霉素A（AA）前后测定耗氧率（OCR）(n个 = 每组9–10口井）。(B类)该图显示了从（A）中的耗氧率（OCR）测量中获得的呼吸参数。(C类和天)在连续添加(C类)洋地黄苷/丙酮酸/苹果酸、ADP和鱼藤酮；或(天)洋地黄素/琥珀酸/鱼藤酮、ADP和AA。每个图右侧的表格显示了每个条件下的呼吸控制率（RCR），它是添加ADP前后OCR之间的比率(n个 = 每组10–15口井）。在所有数字中，结果都是平均值 ± S.D.公司。T型-进行了测试，*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.001,***P（P） < 0.0001.

图3。 — **图3 TMZ诱导衰老过程中葡萄糖分解代谢降低为乳酸。**
在添加(A类)2-脱氧葡萄糖（2-DG）或(C类)草酸盐。(B类和天)基础细胞外酸化对2-DG敏感的比例(B类)或草酸盐(天)分别按照实验部分所述进行计算(n个 = 每组10口井）。结果是平均值 ± S.D.公司。T型-进行了测试，*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.001,***P（P） < 0.0001.

图4。 — **图4 TMZ诱导的衰老细胞线粒体含量和长度增加。**
(A类)细胞用线粒体荧光探针MitoTracker Green FM染色，用流式细胞仪测定线粒体质量。显示了细胞群相对于对照值的几何平均荧光强度(n个 = 每组3个培养皿）。(B类)通过实时PCR评估MtDNA/nDNA比率。结果表示为相对于控制条件(n个 = 每组7个培养皿）。(C类)柠檬酸合成酶活性测量并标准化为10⁶单元格(n个 = 每组6个培养皿）。(天)实时RT-PCR检测PGC-1α的表达。结果表示为相对于控制条件(n个 = 每组3个培养皿）。(E类)用TFAM和微管蛋白抗体进行典型的蛋白质印迹。(F类)从E中定量TFAM蛋白水平，并使用微管蛋白作为负荷控制进行标准化(n个 = 每组7个培养皿）。结果是相对于控制条件表示的。(**G公司**)活细胞的代表性图像用MitoTracker Green FM染色并用共焦显微镜分析（×630）(n个 = 每种情况评估6张幻灯片）。装箱区域的放大图像如下所示。线粒体平均长度如下图所示(n个 = 每组6张幻灯片）。(**H（H）**)线粒体长度的频率分布分析(**G公司**). 统计分析包括列联表和卡方检验(*P（P）* < 0.0001). (我)在×20处获得的代表性电子透射显微镜图像 000（顶部）和×50 000（底部）。底部图像是装箱区域的放大图像。线粒体平均长度如下图所示(n个 = 每个条件3个培养皿）。结果是平均值 ± S.D.公司。T型-进行了测试，*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.001.

图5。 — **图5 TMZ诱导衰老中线粒体融合增加。**
(A类)线粒体融合和分裂蛋白MFN1、MFN2、OPA1、DRP1、FIS1、MFF、SDHA和微管蛋白的代表性蛋白质印迹作为负载对照(n个 = 每组3个培养皿）。(B类)通过密度测定法量化独立蛋白质印迹中的蛋白质水平，并使用微管蛋白作为负荷控制标准化。结果表示为相对于控制条件(n个 = 每组3-10个培养皿）。(C类)实时RT-PCR用于*Mfn1型*,*Mfn2公司*,图1和*Mff公司*.结果是相对于控制条件表示的(n个 = 每组3个培养皿）。(天)SDHA（红色）和DRP1（绿色）共定位的代表性图像。DAPI（蓝色）染色细胞核。皮尔逊相关系数为0.40 ± 0.02用于控制，0.34 ± TMZ为0.02(*P（P）* < 0.05,n个 = 每组4张盖玻片）。方框区域（灰色矩形）的增强图像显示在下部面板中。(E类)富含线粒体或胞浆的亚细胞组分中DRP1、SDHA和微管蛋白的代表性western blot。结果是平均值 ± S.D.公司。T型-进行了测试，*P（P） < 0.05,***P（P） < 0.0001之间。

图6。 — **图6通过细胞分类和线粒体功能和动力学分析分离衰老细胞。**
TMZ处理的细胞通过细胞分选分离。(A类)典型的点图显示了选择的区域，用于分离TMZ处理细胞的两个群体：较大颗粒衰老细胞（大）和较小颗粒非新生细胞（小）。使用相应的对照和TMZ处理的培养物建立了用于选择大小细胞的门控。(B类)细胞分选后评估的SA-β-gal活性测定的定量(n个 = 每个条件3个培养皿）。(C类)获得了呼吸参数，如图2所示(n个 = 每组18–21口井）。(天)活细胞用MitoTracker Green FM染色并用共焦显微镜（×630）分析。显示了方框区域（白色矩形）的代表图像和放大图像。线粒体平均长度如下图所示(n个 = 每组3-6张幻灯片）。(E类)年样本线粒体长度的频率分布分析(天). 统计分析包括列联表和卡方检验(*P（P）* < 0.0001). 结果是平均值 ± 进行S.D.单向方差分析和Tukey事后检验；带有不同字母或星号的组明显不同(*P（P）* < 0.05).

图7。 — **图7：线粒体2沉默影响线粒体大小和功能，并减少TMZ诱导的衰老细胞中IL-6的分泌。**
用携带短发夹（shRNA）靶向的慢病毒颗粒转导黑色素瘤细胞*Mfn2公司*或打乱shRNA（Scr），并在用DMSO或TMZ治疗之前用嘌呤霉素选择。(A类)实时RT-PCRMfn2公司(n个 = 每组4-5个培养皿）。结果是相对于Scr-DMSO条件表达的。(B类)MFN2和微管蛋白的代表性western blot。(C类)western blot中蛋白质水平的量化如所示(B类). 使用微管蛋白作为负荷控制，对MFN2进行标准化，并将结果表示为相对于控制条件（Scr）(n个 = 每组3个培养皿）。(天)活细胞的代表性图像用MitoTracker Green FM染色，并用共焦显微镜（×630）进行分析。(E类)样本线粒体长度的频率分布分析，如(天). 统计分析包括列联表和卡方检验(*P（P）* < 0.0001). (F类)如图2所示获得的呼吸参数(n个 = 每组5-10口井）。治疗、shRNA及其相互作用对基础OCR的主要影响(*P（P）* < 0.0001,*P（P）* = 0.24,*P（P）* < 0.05); ATP依赖OCR(*P（P）* < 0. 0001,*P（P）* = 0.36,*P（P）* < 0.05); 最大OCR(*P（P）* < 0.0001,*P（P）* < 0.05,*P（P）* < 0.0001). (**G公司**)SA-β-gal阳性细胞的定量(n个 = 每组3-6口井）。治疗的主要效果(*P（P）* < 0.0001），shRNA(*P（P）* = 0.99）和相互作用(*P（P）* < 0.05). (**H（H）**)用ELISA分析IL-6分泌水平(n个 = 每组5-6口井）。治疗的主要效果(*P（P）* < 0.0001），shRNA(*P（P）* < 0.001）和相互作用(*P（P）* < 0.001).T型-测试在(A类)和(C类)*P（P） < 0.05,***P（P） < 0.0001. 通过双向ANOVA和Tukey post-hoc对治疗的主要效果、shRNA及其相互作用的统计显著性进行多重比较F类–**H（H）**; 字母不同的组有显著差异(*P（P）* < 0.05). 在所有图表中，结果均为平均值 ± S.D.公司。

图8。 — **图8：线粒体1沉默影响线粒体大小并减少TMZ诱导的衰老细胞的IL-6分泌。**
用携带短发夹（shRNA）靶向的慢病毒颗粒转导黑色素瘤细胞*Mfn1型*或打乱shRNA（Scr），并在用DMSO或TMZ治疗之前用嘌呤霉素选择。(A类)实时RT-PCRMfn1型(n个 = 每组4-5个培养皿）。结果是相对于Scr-DMSO条件表达的。(B类)用抗MFN1抗体（绿色）和DAPI（蓝色）对细胞核进行MFN1染色的代表性图像，通过免疫细胞化学和表观荧光显微镜获得（×1000）。(C类)活细胞用MitoTracker Green FM染色并用共焦显微镜（×630）分析。(天)年样本线粒体长度的频率分布分析(C类). 统计分析包括列联表和卡方检验(*P（P）* < 0.0001). (E类)SA-β-gal阳性细胞的定量(n个 = 每组3-6口井）。治疗的主要效果(*P（P）* < 0.0001），shRNA(*P（P）* < 0.0001）和相互作用(*P（P）* < 0.0001). (F类)ELISA分析IL-6分泌(n个 = 每组3-6口井）。治疗的主要效果(*P（P）* < 0.0001），shRNA(*P（P）* < 0.0001）和相互作用(*P（P）* < 0.0001).T型-测试执行于(A类)***P（P） < 0.0001. 通过双向方差分析和Tukey post-hoc进行多重比较，确定治疗的主要效果shRNA及其相互作用的统计意义(E类和F类)，具有不同字母的组显著不同(*P（P）* < 0.05). 结果是平均值 ± S.D.公司。

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1. Vredeveld L.C.、Possik P.A.、Smit M.A.、Meissl K.、Michallou C.、Horlings H.M.等人（2012年）通过PI3K途径激活消除BRAFV600E诱导的衰老有助于黑色素瘤形成。基因Dev.26，1055–1069 10.1101/gad.187252.112-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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1. Ewald J.A.、Desotelle J.A.、Wilding G.和Jarrard D.F.（2010）《癌症中的治疗诱导衰老》。J.Natl癌症研究所102，1536–1546 10.1093/jnci/djq364-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[2] Campisi J.（2013）《衰老、细胞衰老与癌症》。每年。生理学评论。75、685–705 10.1146/annurev-physiol-030212-183653-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Vredeveld L.C.、Possik P.A.、Smit M.A.、Meissl K.、Michallou C.、Horlings H.M.等人（2012年）通过PI3K途径激活消除BRAFV600E诱导的衰老有助于黑色素瘤形成。基因Dev.26，1055–1069 10.1101/gad.187252.112-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Vredeveld L.C.、Possik P.A.、Smit M.A.、Meissl K.、Michallou C.、Horlings H.M.等人（2012年）通过PI3K途径激活消除BRAFV600E诱导的衰老有助于黑色素瘤形成。基因Dev.26，1055–1069 10.1101/gad.187252.112-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[8] Collado M.和Serrano M.（2010），肿瘤衰老：来自小鼠和人类的证据。《国家癌症评论》10，51–57 10.1038/nrc2772-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Ewald J.A.、Desotelle J.A.、Wilding G.和Jarrard D.F.（2010）《癌症中的治疗诱导衰老》。J.Natl癌症研究所102，1536–1546 10.1093/jnci/djq364-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Ewald J.A.、Desotelle J.A.、Wilding G.和Jarrard D.F.（2010）《癌症中的治疗诱导衰老》。J.Natl癌症研究所102，1536–1546 10.1093/jnci/djq364-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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