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.2019年8月7日；12（1）:48。
doi:10.1186/s13072-019-0291-8。

垂体ERα激活增强子触发Nr5a1（最早的促性腺激素谱系特异性转录因子）表达的鉴定

文森特·帕西尼 1, 弗洛伦斯·佩蒂特 1, 布鲁诺·奎拉特 1, 珍妮·诺埃尔·拉维里埃 1, 若埃尔·科恩·坦努吉 1, 大卫·L’hóte 2
附属公司

一种垂体ERα激活的增强子的鉴定，该增强子触发Nr5a1的表达，Nr5a1是最早的促性腺激素谱系特异性转录因子

文森特·帕西尼等。 表观遗传学染色质. .

摘要

背景：性腺样体谱系分化是垂体发育过程中的一个逐步过程。促性腺激素谱系鉴定的早期阶段以Nr5a1转录因子的表达为特征，该转录因子是决定促性腺细胞命运的关键因素。影响Nr5a1表达的异常会导致性腺机能减退性性腺功能减退和不育。虽然已经获得了控制促性腺激素分化的信号和转录事件的重要知识，但在早期促性腺素谱系规范中调节Nr5a1表达的表观遗传机制仍不清楚。

结果：通过对三种细胞系的ATAC染色质可及性分析，概括了促性腺激素分化的渐进阶段，并在体内对发育中的垂体进行了染色质可及性分析，我们证明了一种尚未描述的增强子在促性腺激素指定过程中被短暂募集。使用CRISPR/Cas9，我们表明该增强子对促性腺激素规范期间Nr5a1的出现是强制性的。此外，我们确定了一种高度保守的雌激素结合元件，并证明增强因子的激活依赖于雌激素通过ERα的作用。最后，我们提供证据表明，ERα的结合对Nr5a1增强子和启动子的染色质重塑至关重要，从而导致RNA聚合酶的招募和转录。

结论：本研究确定了与促性腺激素谱系规范相关的最早调控序列，并强调了ERα在这一分化过程中发挥的关键表观遗传作用。

关键词：增强剂；表生；雌激素受体；性腺形态规范；编号5a1。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
差异染色质可及性编号5a1促性腺激素指定期间的位点。一这个编号5a1该位点根据体外促性腺激素分化阶段显示出不同的局部染色质可及性。通过高通量测序（ATAC-seq）检测αT1-1、αT3-1和LβT2促性腺激素细胞系中转座酶可及染色质的可及性，研究染色质可及性。显示了45 Kb的ATAC-seq轨道编号5a1轨迹。从ATAC-seq结果中确定的可访问染色质区域显示了每个轨迹下的每个细胞系（分别以灰色、蓝色和黄色显示）。在最后一条线中，根据至少一个细胞系中识别的可访问染色质序列，用黑色总结出潜在的调控区域。b条 编号5a1潜在的调节区域根据体内促性腺激素的分化阶段显示出不同的染色质可及性。对来自E12.5、E13.5和E14.5小鼠胚胎发育中腺体的垂体细胞进行ATAC分析，然后进行实时PCR定量（ATAC-qPCR）。定量聚合酶链式反应是使用针对潜在顺式-监管区域。将原始qPCR数据归一化为对照区（见“材料和方法”）和E12.5发育阶段。在这个阶段，编号5a1该基因未表达，该位点预计为闭合染色质构象。结果是平均值 ± 三个独立实验的SEM。使用Mann-Whitney检验比较E12.5和E13.5或E12.5和E24.5胚胎期染色质可及性的变化。与E12.5阶段的显著差异：“a”第页 < 0.05; “b”第页 < 0.01; “c”第页 < 0.001
图2
图2
未描述的早期增强因子的发现编号5a1基因。一,b条和c（c） 编号5a1-根据促性腺激素的分化阶段，可到达的染色质区域具有活性增强剂的差异表观遗传标记。采用染色质免疫沉淀法研究了αT1-1、αT3-1和LβT2细胞系中与ATAC-seq开放区相关的组蛋白H3的表观遗传修饰。分析标记为赖氨酸4三甲基化和单甲基化H3K4me3(一)和H4K4me1(b条)，分别是启动子和增强子的特异性，以及赖氨酸27乙酰化H3K27ac(c（c）)，富含活性顺式-监管序列。使用针对ATAC-seq开放区的一组引物进行定量PCR。将原始qPCR数据归一化为输入数据。最终结果表示为控制区域的折叠。对每个细胞系和每个组蛋白修饰分别进行ANOVA和Dunnett的多重比较试验。结果是平均值 ± 六个独立实验的SEM。与对照区的显著差异：“a”第页 < 0.05; “b”第页 < 0.01.d日 编号5a1-可接触染色质区域显示差异顺式-调节活性取决于促性腺激素分化阶段。αT1-1、αT3-1和LβT2细胞瞬时转染顺式-在含有最小催乳素启动子（Pluc–Prl）的pGL3b荧光素酶报告系统中克隆的调控区域。按照“材料和方法”中的说明测量相对荧光素酶活性。ANOVA和Dunnett的多重比较试验分别对每个细胞系进行。将结果归一化以控制Pluc–Prl质粒，结果为平均值 ± 六个独立实验的SEM。与对照结构的显著差异：“a”第页 < 0.05; “b”第页 < 0.01
图3
图3
α增强子调节编号5a1在不成熟的促性腺激素中特异性表达。一α增强子根据促性腺激素分化阶段表现出不同的DNA CpG甲基化状态。提取αT1-1、αT3-1和LβT2细胞的基因组DNA并进行亚硫酸化。扩增并克隆了FL增强子和α增强子亚硫酸氢序列。每个细胞系至少有五个克隆被测序。上图：增强子序列与CpG（开环棒棒糖）位置的示意图。编号是相对于编号5a11A启动子TSS。每个细胞系的CpG甲基化状态，甲基化（黑圈）或非甲基化（开圈）如下所示。b条关于编号5a1在未成熟的αT3–1细胞中，表达依赖于α增强子序列。使用CRISPR/Cas9和两个独立的特异性引导RNA（gRNA）对每个增强子序列的侧翼进行FL和α增强子基因组序列的删除：α增强器的αgRNA1-gRNA3或αgRNA2-gRNA4，FL增强子的FL gRNA1-gRNA3或者FL gRNA 2-gRNA 4，如附加文件7所述。以非靶向对照gRNA为对照。对于每对gRNA，对三个独立的纯合克隆进行测试编号5a1RT-qPCR表达。编号5a1表达水平标准化为Gapdh公司数据为归一化平均值 ± 六个独立实验的SEM。用方差分析比较WT和ΔFL enhαT3-1或ΔαenhαT1克隆，然后进行Dunnett的多重比较试验。与WT的显著差异：“c”第页 < 0.001.c（c）α增强子是编号5a1在未成熟的αT3-1细胞中。使用与赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶LSD1编码序列（dCas9-LSD1）融合的CRISPR/dCas9在αT3-1细胞中解除α增强子。dCas9–LSD1使用αgRNA1–gRNA3或αgRNA2–gRNA4 gRNA对靶向α增强子基因组序列。以非靶向对照gRNA（Ctr gRNA）为对照。使用细胞术细胞分类检索25%的高转染细胞，并测试其编号5a1RT-qPCR表达。编号5a1表达水平标准化为Gapdh公司数据为归一化平均值 ± 三个独立实验的SEM，并与使用Student’st吨测试“b”第页 < 0.01.d日α增强子与编号5a1垂体启动子在祖细胞和未成熟细胞中的表达。顶部：定量c（c）染色质c（c）信息c（c）捕获(c（c）)检测在αT1-1和αT3-1细胞中进行。使用靶向α增强子的固定正向引物和靶向1G垂体启动子序列上游、内部或下游区域的多个正向引物检测嵌合DNA片段，如编号5a1结构。Ce（位点控制区外）、FL（胎儿Leydig增强子）、1G（1G启动子）、α（α增强子。外显子表示为暗条，调控区表示为绿色条，α增强子表示为紫色条。编号是相对于1A启动子TSS。底部：3C文库中嵌合片段的qPCR测量直方图。将原始qPCR数据归一化为输入和Ci/α嵌合DNA，以控制非特异性连接事件。使用RP23 225F7细菌人工染色体（BAC）创建模板，以定量测量3C文库中的嵌合区域。数据是平均值 ± 对四个独立实验的SEM进行了方差分析，然后进行了Dunnett的多重比较测试。与Ci/α的显著差异：“b”第页 < 0.01; “c”第页 < 0.001，nd：未检测到
图4
图4
ERα控制顺式-α增强子的调节活性。一α增强子的65-bp核心序列在哺乳动物基因组中是保守的。在Ensembl网站上检索到31种哺乳动物的α增强子基因组序列，并使用Clustal Omega软件进行比对。65 bp的核心序列在不同物种之间表现出明显的保守性。在这个核心序列中，观察到与典型ERE结合位点（红条和ERE结合基序）的完美匹配。b条65-bp核心序列中的ERE结合位点对α增强子至关重要顺式-未成熟αT3-1细胞的调节活性。将αT3–1细胞瞬时转染到完整的含类固醇的培养基中，所述Pluc构建物包含用作对照的最小催乳素启动子（Pluc–Prl）、全长α增强子（Pluc-αenh）、截短α增强器（Pluc-αenhΔ65，含有65-bp核心序列的缺失）、，一个减少的α增强子（Pluc–αenh+65，仅包含65-bp核心序列）或一个突变的α增效子（Pluc-αenh MutERE，ERE结合位点发生以下突变：GATCAATGATC）。Prl最小启动子以深色表示，其次是荧光素酶编码序列，以绿色表示，α增强子以蓝色表示，其中65 bp核心序列以橙色表示，ERE结合位点以黄色表示。ERE突变用星号表示。按照“材料和方法”中的说明测量相对荧光素酶活性。结果归一化为Pluc–Prl作为对照，为平均值 ± 六个独立实验的SEM。与对照组的比较采用方差分析，然后进行Dunnett多重比较检验。与Pluc–Prl控制的显著差异：“c”第页 < 0.001.c（c） Erα但不是Erβ在未成熟的αT3-1细胞中表达。提取αT1-1、αT3-1和LβT2细胞的总RNA并进行逆转录。mRNA水平Erα和Erβ按照“材料和方法”中的说明进行量化。结果标准化为Gapdh公司和是平均值 ± 四个独立实验的SEM。进行方差分析，然后进行Bonferroni的事后比较测试，以进行比较Erα在不同细胞系中表达。显著差异：“a”第页 < 0.05和“b”第页 < 0.01. Nd：未检测到。d日在未成熟的αT3-1细胞中，内源性ERα与α增强子染色质结合。使用抗雌激素受体α-ChIP-grade抗体（abcam ab32063）对αT3-1细胞系中的ChIP分析来研究ERα与α增强子染色质的结合。使用靶向α增强子序列（αenh）的引物进行定量PCR。将原始qPCR数据归一化为输入数据。最终结果表示为对照区（Ctr区）的折叠。结果是平均值 ± 四个独立实验的SEM。使用Student’st吨-测试：“c”第页 < 0.001.电子这个顺式-α增强子的调节活性严格依赖于Erα表达式级别。αT3–1细胞与对照（Pluc–Prl）或全长α增强子（Pluc-αenh）构建物和打乱或ErαSiRNA。按照“材料和方法”中的说明测量相对荧光素酶活性。将结果归一化以控制Pluc–Prl质粒，平均值为 ± 六个独立实验的SEM。使用Student’st吨测试“c”第页 < 0.001.（f）ERα激动剂和拮抗剂调节α增强子顺式-监管活动。用对照（Pluc–Prl）或全长α增强子（Pluc–αenh）构建体瞬时转染αT3–1细胞。在指定浓度下，用载体E2或ICI 182780处理转基因细胞。按照“材料和方法”中的说明测量相对荧光素酶活性。对对照组Pluc–Prl的结果进行标准化，结果为平均值 ± 六个独立实验的SEM。进行方差分析，然后进行Dunnett的多重比较试验，以比较不同浓度的药物与溶媒。与车辆的显著差异：“c”第页 < 0.001
图5
图5
ERα控制编号5a1通过α增强子的表观遗传调控表达。一使用CRISPR/Cas9在未成熟αT3-1细胞中删除α增强子ERE结合位点。使用CRISPR/Cas9和ERE序列两侧的一对特异性gRNA在αT3-1细胞中删除α增强子中的ERE基因组序列。以非靶向gRNA作为对照。对两个用于缺失和控制gRNA的独立纯合克隆进行测序。WT和缺失ERE（ΔERE）αT3-1克隆的基因组序列以及ERE基序和ΔERE-gRNA位置。b条在未成熟的αT3-1细胞中，α增强子ERE的缺失阻止了ERα与增强子染色质的结合。在WT和ΔEREαT3-1克隆中，使用ChIP分析研究ERα与α增强子染色质的结合。使用靶向α增强子基因组序列的引物进行定量PCR。将原始qPCR数据归一化为输入数据。最终结果表示为控制区域的折叠。结果是平均值 ± 六个独立实验的SEM。使用Student’st吨-测试：“c”第页 < 0.001.c（c）α增强子中完整的ERα结合位点对于编号5a1在未成熟的αT3-1细胞中表达。编号5a1RT-qPCR检测WT和ΔEREαT3-1细胞的表达。编号5a1表达水平标准化为Gapdh公司数据为归一化平均值 ± 六个独立实验的SEM。使用Student’st吨-测试：“c”第页 < 0.001.d日α增强子ERα结合位点的缺失导致未成熟αT3-1细胞中α增强器染色质可及性的强烈降低。使用DNAse I超敏反应（DNAse I HS）分析法对WT和ΔEREαT3-1克隆的α增强子染色质可及性进行了研究。使用靶向α增强子基因组序列的引物进行定量PCR。将原始qPCR数据归一化为输入数据。最终结果表示为控制区域的折叠。结果是平均值 ± 四个独立实验的SEM。使用Student’st吨-测试：“c”第页 < 0.001.电子在未成熟的αT3-1细胞中，α增强子中ERα结合位点的缺失可阻止活性染色质标记沉积在α增强器和1G启动子上。使用ChIP分析在WT和ΔEREαT3-1克隆中研究了Lys4（H3K4me1）的单甲基化、Lys27在组蛋白H3上的乙酰化和Lys4的三甲基化表观遗传修饰，以及P300和丝氨酸5-磷酸化RNA聚合酶II（S5P-Pol II）与α增强子和/或1G启动子序列的结合。使用针对α增强子或1G启动子序列的一组引物进行定量PCR。将原始qPCR数据归一化为输入数据。最终结果表示为控制区域上的折叠。结果是平均值 ± 六个独立实验的SEM。每个标记和每个标记的WT和ΔEREαT3-1克隆之间存在显著差异顺式-使用Student的t吨-测试：“b”第页 < 0.01; “c”第页 < 0.001.（f）α增强子ERα结合位点的缺失导致未成熟αT3-1细胞中α增强器染色质的CpG超甲基化。提取WT和ΔEREαT3-1克隆的基因组DNA并进行亚硫酸化。扩增并克隆了α增强子-亚硫酸氢序列。每个细胞系至少有9个克隆被测序。上图：α增强子序列与CpG（开环棒棒糖）和ERE位点位置的示意图。以下是每个细胞系的CpG甲基化状态，甲基化（黑圈）或非甲基化（开圈）
图6
图6
表观遗传机制触发的示意图编号5a1在促性腺激素规范的早期阶段表达。在祖细胞中编号5a1该位点主要是一种受抑制的构象：TFs尚无法进入该位点，DNA甲基化，该基因未表达。虽然启动子还没有任何活化的表观遗传标记，但α增强子已经启动。有趣的是，α增强子已经在垂体1G启动子上循环，并且α增强器的染色质可及性有限，允许配体活化的ERα结合。ERα仅在增强子上招募有限数量的P300，允许低水平的组蛋白乙酰化。因此，α增强子处于二价状态，基因处于激活边缘。在未成熟的促性腺激素中，CpG去甲基化，α增强子上的染色质可及性显著增加，P300募集和组蛋白乙酰化。这些表观遗传修饰依赖ERα。α增强子的激活允许组蛋白乙酰化和垂体1G启动子上RNA Pol II的募集，因此编号5a1转录。α增强子抑制状态和激活状态之间的转换可能部分是由于ERα共激活物的招募，这些共激活物将被抑制或尚未在祖细胞中表达
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