细胞周期蛋白C的线粒体易位通过Bax募集刺激内源性凋亡
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PMID： 31385392 -
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内政部： 10.15252年11月2日1847425
细胞周期蛋白C的线粒体易位通过Bax募集刺激内源性凋亡
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利益冲突声明
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A、 B类 在（A）和（B）H之前和之后，对野生型MEF培养物的细胞核（DAPI）、细胞周期蛋白C（间接免疫荧光）和线粒体（MitoTracker Red）进行染色 2 O（运行） 2 治疗（0.4 mM，4小时）。 收集并分析共焦图像，以便在细胞内使用 z（z） 指示强度的轴。 红色和绿色的峰表示细胞周期蛋白C和线粒体之间的共定位。注意，细胞周期蛋白C的阴影通常位于峰的一侧，表示与线粒体末端的关联，表明在裂变中起作用。 棒材=10μm。 C类 正常Bax活化需要细胞周期蛋白C。 用顺铂（CP）（30 mM，16 h）处理具有指定基因型的MEF培养物，然后通过荧光显微镜观察细胞核（DAPI）、细胞周期蛋白C（IF）和活化Bax（IF。 图像合并在第四列。 检查的每个部件的图像曝光是相同的。 条形图表示20μm。 最右侧提供了缩放图像（4倍）（条=10μm）。 D类 对具有指定基因型的MEF培养物的细胞周期蛋白C核释放进行定量。 当细胞周期蛋白C总信号>15%为细胞质时，核释放得分为阳性。 添加半胱天冬酶抑制剂Z‐VAD‐FMK以防止细胞凋亡的启动，从而对整个人群进行计数。 测量了三个独立培养物，每个培养物100个细胞。 错误条表示SD，星号表示 P（P） 使用学生的 t吨 ‐测试。 注意在非应激状态下细胞周期蛋白C核释放增加[ Bax； 贝克 ] −/− 细胞。 E类 无应力WT和[ 贝克 ； Bax公司 ] −/− 对MEF细胞进行细胞核（DAPI）和线粒体（MitoTracker）染色。 WT细胞线粒体形态显示正常的网状结构。 双突变体细胞表现出中间表型，显示出部分破碎的线粒体，但未达到应激细胞中观察到的程度（见图EV1B）。
WT和 中国网通 −/− MEF培养物用0.4 mM H处理 2 O（运行） 2 如图所示，制备提取物并用识别Bax活性构象的抗体进行免疫沉淀。 对免疫沉淀物进行Western blot分析，并检测总Bax或cyclin C。对全细胞提取物（WCE）进行Westernblot分析以控制提取物中的蛋白质浓度。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 细胞周期蛋白C和Bax直接相互作用。 重组Bax和SUMO-His 6 将细胞周期蛋白C在室温下一起或单独培养，然后传递给Co 2+ 树脂。 对洗脱物进行蛋白质印迹分析，探测Bax和细胞周期蛋白C（泳道4-6）。 每个样本（1/10）的输入控制包括在通道1-3中。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 细胞周期蛋白C的线粒体重新定位是Bax激活所必需的。 重复（A）中描述的实验，但H 2 O（运行） 2 如图所示，用1μM吡氟菊酯μ（PFT）处理细胞24小时。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 高效Bax‐Bcl‐X需要Cyclin C 我 解离。 用H处理后从具有指定基因型的MEF细胞制备的提取物 2 O（运行） 2 （0.4 mM，4 h）用普通Bax抗体免疫沉淀。 免疫沉淀用Bcl‐X进行Western blot分析 我 抗体。 Western blot分析WCE作为输入浓度对照。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 线粒体裂变复合体是细胞周期蛋白C依赖性Bax活化所必需的。 从MEF培养物中制备提取物，所示基因型经H处理 2 O（运行） 2 （0.4 mM，4小时）。 提取物按（A）处理。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 细胞周期蛋白C–Bax相互作用需要Drp1。 提取物由野生型或 图纸1 −/− MEF培养物是否用H处理 2 O（运行） 2 并分析是否存在Bax和cyclin C，如（A）所述。 分子量标记（kDa）显示在左侧。
在S‐HAD处理之前（对照）和之后（10μM，4小时）固定野生型MEF细胞； 然后，用荧光显微镜观察细胞核（DAPI）、细胞周期蛋白C（间接免疫荧光）和线粒体（线粒体追踪红）。 合并面板仅显示DAPI染色（蓝色）。 缩放面板（4×）由合并面板中的框表示。 绿色箭头表示细胞周期蛋白C和线粒体共定位。 条形图表示10μM。 野生型和 中国网通 −/− 用S-HAD（10μM）处理MEF细胞达到指定时间( n个 = 3). 误差条表示SD。星号表示 P（P） 预处理对照值<0.05（学生 t吨 ‐测试）。 S-HAD肽活性需要细胞周期蛋白C。用 中国网通 −/− MEF文化。 条形图表示10μm。 结果在（B）中进行了量化。 S-HAD治疗增加Bax线粒体定位。 S‐HAD治疗前后（10μM，4 h）对细胞核和线粒体部分的指示蛋白质进行Western blot分析。 Atp5A和纤维蛋白水平分别控制线粒体和核负荷。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 在用S-HAD（10μM）处理的野生型MEF培养物中监测Bax活化的时间。 在S-HAD处理前2 h添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）（1 mM）。 如图所示，对活性Bax免疫沉淀物进行Bax和cyclin C的Western blot分析。 作为输入对照，监测提取物制剂中Bax、cyclin C和β-actin的水平。 分子量标记（kDa）显示在左侧。
通过荧光细胞分析，在用S-HAD（10μM，24 h）或顺铂（CP，30μM，16 h）处理的野生型MEF细胞中测量Caspase激活。 n个 = 3. 误差条表示SD。*和**表示 P（P） <0.05和 P（P） 分别<0.01，使用Student’s t吨 测试。 S-HAD处理未诱导PARP裂解。 如（A）所述，通过Western blot分析监测用S-HAD或顺铂（CP）处理的HeLa细胞中PARP的裂解。 剥离印迹，并用β-actin抗体进行重制，作为负荷对照。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 野生型和 中国网通 −/− 如前所述，用S‐HAD和顺铂（CP）处理MEF培养物。 对细胞进行成像和检查，以确定死亡的“四舍五入”表型诊断（定量见图EV4A）。 细胞周期蛋白C是正常Bax齐聚反应顺铂所必需的。 由DSP交联野生型和 中国北卡罗来纳州 −/− 检测MEF细胞暴露于顺铂（30μM，16 h）后的Bax总量。 指示Bax多聚物。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 S-HAD不会诱导Bax齐聚。 用S-HAD处理的培养物（10μM，24 h）重复（D）中所述的实验。 指示Bax多聚物。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 S‐HAD治疗使Hela细胞对顺铂敏感。 如图所示，用顺铂（30μM）、S-HAD（10μM）和N-乙酰半胱氨酸（NAC，1 mM）处理Hela培养物。 荧光细胞分析分别用于量化凋亡（Annexin V阳性）和坏死（PI阳性）人群百分比。 n个 =3种独立的文化。 错误条表示SD。星号表示 P（P） <0.05（学生的 t吨 ‐测试）。
用载体（对照）、S‐HAD（10μM，24小时）或顺铂（CP，30μM，16小时）处理野生型MEF培养物，并计算仍粘附在培养皿上的细胞百分比。 结果显示来自三种独立培养基，误差条表示SD，n.s.=无统计差异*** P（P） <0.001，由学生计算 t吨 测试。 S‐HAD增强的凋亡需要细胞周期蛋白C。 使用Annexin V染色法测量细胞凋亡效率 中国网通 −/− 用顺铂（30μM，24 h）处理MEF培养物，添加或不添加4 h S-HAD( n个 = 3). 误差条表示SD。在单独顺铂处理的培养物中，Annexin V阳性细胞的百分比设置为1。
A类 S-HAD处理诱导线粒体ROS。 野生型和 中国网通 −/− MEF培养物用S‐HAD（10μM，24 h）、鱼藤酮或载体对照物处理，如图所示。 通过线粒体SOX染色（4μM，15 min）和定量共焦成像测量线粒体ROS。 误差条指示SD。 n个 =3，星号表示 P（P） <0.05（学生的 t吨 ‐测试），不另作说明，无显著差异。 B类 抑制线粒体活性氧减少细胞周期蛋白C–Bax相互作用。 野生型和 中国网通 −/− 用S-HAD（10μM，16 h）和100 nM线粒体特异性活性氧清除剂MitoTEMPO处理MEF培养物。 蛋白质印迹分析如图1所示。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 C类 胰岛素治疗刺激S-HAD诱导的Bax活化。 野生型和 中国网通 −/− MEF培养物在添加或不添加胰岛素（10μg/ml）的情况下生长，然后用S‐HAD处理（10μM，4 h）。 制备线粒体和细胞溶质部分，并探测指示蛋白。 Atp5A和β-actin水平分别控制线粒体和细胞溶质负荷。 两个印迹的制备、处理和显影完全相同。 分子量标记（kDa）显示在左侧。 D、 E类 PCD诱导应激前（D）和后（E）Bax线粒体关联模型。 在非应激细胞中，Bax持续对MOM进行取样，但不插入MOM，并被促生存蛋白（Bcl-2，Bcl-X）清除 我 )在一个被称为逆向易位的过程中。 为了应对压力，细胞周期蛋白C与Bax结合，以裂变复合物依赖的方式稳定其与MOM的相互作用。 延长停留时间使Bax更有效地被应激激活的BH3蛋白靶向。 仅BH3蛋白结合诱导构象变化，促进Bax-MOM插入、同源二聚体形成和低聚，最终导致PCD（详见正文）。
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引用人
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